DLC1與RhoA表達影響乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的初探

周　密，歐小波，冉啟梅

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 臨床醫(yī)學系 ，廣東 珠海　519041；2.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 病理學教研室，廣東 珠海　519041)

近年乳腺癌已成為女性惡性腫瘤死亡的主要原因之一，在我國其發(fā)病率和死亡率也呈迅速增長趨勢[1]，部分患者往往因就診不及時導致就醫(yī)時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，從而大大降低了治愈率。因此，研究乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，尋找可能抑制其轉(zhuǎn)移的相關(guān)靶點，對乳腺癌的臨床治療十分重要。肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1,DLC1)由Yuan等在原發(fā)性肝癌中首次分離和報道，其作為抑癌基因，在多種惡性腫瘤細胞中表達缺失或減少[2-4]。RhoGAP是DLC1抗腫瘤的主要結(jié)構(gòu)域，而與DLC1分子結(jié)構(gòu)有一定聯(lián)系的RhoA(ras homologue A)在多種惡性腫瘤細胞中表達增加，且可通過激活Rho蛋白激酶(rho associated coiledcoil-forming protein kinase，ROCK)促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[5-7]，故本研究擬通過免疫細胞化學法和Western Blot實驗分別檢測DLC1、RhoA在兩株不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細胞株中的表達，探討DLC1、RhoA對乳腺癌細胞株轉(zhuǎn)移能力的影響。

1　材料與方法

1.1細胞株乳腺癌MCF-7細胞及乳腺癌MDA-MB-231細胞株(凱基生物)。

1.2主要試劑濃縮型DAB及免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，細胞培養(yǎng)液高糖DMEM和RPMI1640(Gibco)，胎牛血清(四季青)，DLC1antibody(工作濃度為1∶4 000，Gene Tex)，RhoA antibody(工作濃度為1∶500，北京博勝經(jīng)緯科技有限公司)。內(nèi)參抗體GAPDH、兔抗人二抗、BCA蛋白定量試劑盒及凝膠制備試劑等均購自博士德生物公司。

1.3主要儀器電泳儀(北京六一DYCP-24DN)，酶標儀(賽默飛Multiskan Mk3)，恒溫搖床(湘儀HY-1000)，半干轉(zhuǎn)印儀(BID-RAD Trans-Blot SD)，ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)(BID-RAD Universal Hood II)等。

1.4方法

1.4.1兩株乳腺癌細胞遷移及侵襲實驗將100 μL濃度為3×105個/mL的乳腺癌MDA-MB-231細胞懸液(不含胎牛血清)加于Transwell小室(濾膜直徑6.5 mm，孔徑8 μm)的上室(侵襲實驗上室事先平鋪60 μL基質(zhì)膠)，下室加入500 μL細胞培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h(侵襲實驗培養(yǎng)12 h)后取出，擦除上室未遷移(侵襲)細胞(下室未見腫瘤細胞)，經(jīng)固定，清洗，HE染色后觀察，計數(shù)遷移(侵襲)細胞總數(shù)，實驗重復3次，計算其平均值。MCF-7細胞株據(jù)上述方法和步驟操作。

1.4.2免疫細胞化學法檢測兩株細胞的DLC1和RhoA表達將備好的無菌蓋玻片置于細胞培養(yǎng)6孔板，加入事先備好的細胞懸液制作細胞爬片，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞鋪滿蓋玻片，吸出培養(yǎng)液，PBS清洗3次后，4%多聚甲醛固定35 min，據(jù)免疫組化染色試劑盒操作說明書操作，封片，光學顯微鏡下觀察，并計數(shù)每100個細胞中陽性細胞的數(shù)目，共取5個高倍視野計算其平均值，陽性結(jié)果判定標準為DLC1和RhoA均在胞漿中表達，細胞顯色為黃色或棕黃色。實驗重復3次。

1.4.3Western Blot檢測兩株細胞的DLC1和RhoA水平按操作說明書提取細胞總蛋白，測定濃度、變性、分裝、保存待用；據(jù)分子量大小配制不同濃度的凝膠進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠80 V,分離膠120 V)，電泳結(jié)束后，根據(jù)marker條帶的指示截取目的蛋白所在的凝膠，半干式轉(zhuǎn)膜(NC膜，10V，35 min)，5%脫脂奶粉37 ℃封閉90 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h后，于暗室中顯色，曝光，顯影，定影。ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)掃描儲存，Image J專業(yè)圖像分析軟件對圖像進行分析并記錄光密度值。

2　結(jié)果

2.1兩株細胞的遷移及侵襲能力比較乳腺癌MCF-7細胞的遷移細胞數(shù)平均26.60±4.96個 ，侵襲細胞數(shù)平均18.20±4.66個 ，而乳腺癌MDA-MB-231 細胞的遷移細胞數(shù)平均103.20±4.17個 ，侵襲細胞數(shù)平均67.00±9.42個 ，兩株細胞遷移及侵襲細胞數(shù)的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗結(jié)果驗證乳腺癌MCF-7細胞的遷移及侵襲能力低于乳腺癌MDA-MB-231細胞。結(jié)果(見圖1)。

A：乳腺癌MCF-7細胞遷移實驗HE染色結(jié)果；B：乳腺癌MCF-7細胞侵襲實驗HE染色結(jié)果；C：乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移實驗HE染色結(jié)果；D：乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲實驗HE染色結(jié)果；HE×400。圖1　兩株細胞遷移、侵襲實驗HE染色結(jié)果

2.2免疫細胞化學檢測DLC1及RhoA在兩株細胞的表達DLC1在乳腺癌MDA-MB-231細胞爬片中呈現(xiàn)陽性表達的細胞數(shù)較乳腺癌MCF-7細胞中少，且DAB染色更淺，而RhoA則在乳腺癌MDA-MB-231細胞爬片中呈現(xiàn)陽性表達的細胞數(shù)較乳腺癌MCF-7細胞中多，且DAB染色更深，如圖2所示。二者在高倍鏡下陽性表達數(shù)具體(見表1)。

A：DLC1在乳腺癌MDA-MB-231細胞胞漿中表達；B：DLC1在乳腺癌MCF-7細胞胞漿中表達；C：RhoA在乳腺癌MDA-MB-231細胞胞漿中表達；D：RhoA在乳腺癌MCF-7細胞胞漿中表達；SP×400。圖2　免疫細胞化學DAB染色檢測結(jié)果

表1高倍鏡下DLC1和RhoA的陽性細胞數(shù)

細胞株DLC1RhoAMDA-MB-23174.800±3.0395.400±1.82MCF-794.400±1.82?82.400±1.67?

*P<0.05,與MDA-MB-231比較。

2.3Western Blot檢測兩株細胞的DLC1及RhoA水平分別對DLC1及RhoA蛋白在兩株細胞的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)DLC1及RhoA在兩株細胞中均有表達，且DLC1在 乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達比乳腺癌MCF-7細胞中低，而RhoA在 乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達比乳腺癌MCF-7細胞中高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。經(jīng)ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)掃描，它們在兩株細胞中的表達如圖3所示，相對光密度值(見表2)。

1:MDA-MB-231細胞；2:MCF-7細胞。 　　圖3　乳腺癌MDA-MB-231細胞和乳腺癌MCF-7細胞中DLC1及RhoA的表達

表2Western blot檢測DLC1和RhoA在兩細胞株的表達

細胞株DLC1RhoAMDA-MB-2310.59±0.141.04±0.02MCF-7 0.87±0.05?0.59±0.07?

*P<0.05,與MDA-MB-231比較。

3　討論

眾所周知，細胞運動能力增強、細胞表面黏附分子改變及黏著斑形成和細胞外基質(zhì)降解是惡性腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎，因此研究乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素可從以上環(huán)節(jié)出發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)RhoA-ROCK信號通路的激活可調(diào)節(jié)肌動蛋白微絲骨架的聚合，也可影響細胞-細胞外基質(zhì)間的黏附[8]，還可酸化腫瘤微環(huán)境增強細胞外基質(zhì)的降解[9]，以上作用均能促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。而DLC1作為它的一個上游分子，也可調(diào)控RhoA在腫瘤細胞中的表達。本研究通過Transwell小室實驗證明了乳腺癌MCF-7細胞的遷移及侵襲能力明顯低于乳腺癌MDA-MB-231細胞。經(jīng)免疫細胞化學法分別對DLC1和RhoA在兩株轉(zhuǎn)移能力不同的乳腺癌細胞中的表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，DLC1和RhoA在兩株乳腺癌細胞胞漿中均有表達，且與高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞株中的陽性細胞數(shù)相比，DLC1在低轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞株中的陽性細胞數(shù)表達更高，而RhoA在高轉(zhuǎn)移乳腺癌MDA-MB-231細胞中陽性細胞數(shù)表達高于低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細胞，由此初步推測DLC1和RhoA的表達水平可能對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移有一定影響；而經(jīng)Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)，DLC1和RhoA在兩細胞株中的表達與免疫細胞化學法的檢測結(jié)果基本一致，即在高轉(zhuǎn)移乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達相較于低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細胞中的表達，DLC1表達下調(diào)，而RhoA表達上調(diào)，由此說明DLC1可能抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，RhoA可能促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhu等[10]也通過在乳腺癌細胞中，經(jīng)黃酮類化合物誘導產(chǎn)生活性氧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLC1表達上調(diào)，RhoA表達下調(diào)，且抑制了乳腺癌細胞遷移，此研究結(jié)果與本實驗結(jié)果基本一致。結(jié)合本課題前期發(fā)現(xiàn)DLC1與RhoA在乳腺癌病變組織中的表達呈負相關(guān)[11]，此外，基于DLC1與RhoA密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)，進一步推測DLC1可能通過下調(diào)RhoA的表達來減弱RhoA-ROCK信號通路的作用，從而抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Seo等[12]通過抑制ROCK及其下游分子肌球蛋白Ⅱ發(fā)現(xiàn)細胞黏著斑的形成顯著減少，Vahle等[13]也通過抑制小鼠黑色素瘤細胞中Na+-H+交換蛋白1(Na+-H+exchanger1,NHE1)的活性發(fā)現(xiàn)，小鼠黑色素瘤細胞體外的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低，以上研究均與RhoA-ROCK信號通路相關(guān)，那么受DLC1調(diào)控后的RhoA-ROCK信號通路對抑制乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的具體作用機制是否與乳腺癌細胞黏著斑的形成減少及Na+-H+交換蛋白1活性降低等有關(guān)呢？本課題將進一步研究后分析討論。

課題組通過檢測DLC1、RhoA在不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細胞株中的表達水平，探討了DLC1、RhoA與乳腺癌細胞株轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性及其作用，并推測了DLC1抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的部分作用機制，為臨床上通過聯(lián)合檢測DLC1與RhoA在乳腺癌細胞中的表達來評估乳腺癌細胞生物學行為，從而進一步評估乳腺癌預后的可能性提供了一定理論依據(jù)，同時為DLC1和RhoA可能成為臨床上治療乳腺癌的新靶點及期望成為評價其療效的新指標提供了一定理論基礎。