AR與Cyclin D1在非特殊型浸潤性乳腺癌不同分子分型中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系

陳春兵，周正平，楊　華，袁　丹，劉俊江

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 電鏡室，貴州 遵義　563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義　563099；4.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 影像科，貴州 遵義　563000)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，2017年美國新發(fā)乳腺癌252 710例，占女性全部新發(fā)惡性腫瘤的30%，是發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤。在我國，隨著乳腺癌發(fā)病率明顯增高及年輕化，在某些城市和地區(qū)，現(xiàn)已成為發(fā)病率最高的女性腫瘤[1-2]。

在臨床病理診斷過程中，根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor ，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor -2，HER2)和 Ki-67等免疫組織化學(xué)標記物在乳腺癌組織中的表達情況，將乳腺癌進行病理分子分型：①Lumial A型(ER+/PR+、HER2-、Ki-67< 20 %)；②Lumial B型：包括HER2陰性型(B1型)[ER+/PR +、HER2-、Ki-67≥20%]和HER2陽性型(B2 型) [ER+/PR+、HER2+]；③HER2過表達型(ER-、PR-、HER2+)；④基底細胞樣型/TNBC[ER-、PR-、HER2-、CK5/6+/EGFR+]，習(xí)慣統(tǒng)稱為TNBC[3]。不同分子分型的乳腺癌患者需要采取不同的治療方案。

雄激素受體(androgen receptor，AR)、Cyclin D1分別為甾體激素激活轉(zhuǎn)錄因子和細胞周期蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AR和Cyclin D1與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4-5]，但關(guān)于二者與浸潤性乳腺癌分子分型及臨床病理特征關(guān)系的研究較少。因此，本研究擬選取88例非特殊型浸潤性乳腺癌患者存檔的石蠟組織，通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)技術(shù)Envision二步法聯(lián)合檢測AR與Cyclin D1蛋白在其中的表達情況，研究二者在非特殊型浸潤性乳腺癌不同分子分型中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，為臨床判斷乳腺癌生物學(xué)行為、制定乳腺癌患者個體化治療方案提供一定的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標本來源收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2013年9月至2017年8月存檔的非特殊型浸潤性乳腺癌石蠟標本88例，均經(jīng)病理科兩位老師重新閱片確診。所有患者均為女性。根據(jù)2012年WHO乳腺腫瘤組織分類[6]：Ⅰ級13例，Ⅱ級57例，Ⅲ級18例。年齡：27～76歲，中位年齡49.86歲；腫瘤大?。?2 cm 35例，2～5 cm 33例，>5 cm 9例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移46例，無轉(zhuǎn)移42例；臨床分期：T1期26例，T2期42例，T3期8例，T4期12例。所有患者術(shù)前均未行放化療等治療。根據(jù)ER、PR、HER2、Ki-67等免疫組化表型進行分子分型：Luminal A型16例，Luminal B型37例，HER2過表達型13例，TNBC 22例。

1.2主要試劑鼠抗人AR單克隆抗體、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體、免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒(鼠/兔)、抗原修復(fù)緩沖液(粉劑型檸檬酸法)、緩沖液(PBS磷酸鹽法)、Ultra DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。鼠抗人AR、兔抗人Cyclin D1工作濃度均為1∶100。

1.3方法將存檔的非特殊型浸潤性乳腺癌組織蠟塊4 μm厚連續(xù)切片，然后進行免疫組化Enivision 法染色，蘇木精復(fù)染，透明封片。用前列腺增生組織作為AR蛋白表達的陽性對照，用套細胞淋巴瘤組織作為Cyclin D1蛋白表達的陽性對照，用PBS代替一抗作為非特殊型浸潤性乳腺癌組織陰性對照。組織抗原均采用高壓修復(fù)，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書要求操作(見圖1)。

A：AR蛋白陰性對照(×400)； B：AR蛋白陽性對照(×400)； C：Cyclin D1蛋白陰性對照(×400)； D：Cyclin D1蛋白陽性對照(×400)。圖1　AR與Cyclin D1蛋白陰性對照及陽性對照

1.4結(jié)果判讀AR蛋白主要表達于細胞核，陽性細胞染色呈棕黃色或棕褐色，根據(jù)陽性細胞的百分比進行判定[7]：陽性細胞數(shù)<10%為陰性表達；陽性細胞占數(shù)10%～25%為弱陽性表達；陽性細胞數(shù)占26%～50%為陽性表達；陽性細胞數(shù)>50%為強陽性。本實驗將陰性表達定為陰性(-)，將弱陽性、陽性和強陽性表達定為陽性(+)。Cyclin D1蛋白主要表達于細胞核，采用 Fromowitz[8]陽性細胞半定量分級法：陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；細胞染色強度，陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。本實驗根據(jù)陽性細胞數(shù)與相應(yīng)染色強度之和判定染色結(jié)果：0～1分定為陰性(-)，2～7分定為陽性(+)。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。運用χ2檢驗和秩和檢驗，不符合χ2檢驗條件的使用Fisher確切概率法，多組組間比較有差異者進行兩兩比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌不同分子分型組織中的表達情況88例非特殊型浸潤性乳腺癌組織中，AR蛋白陽性表達率為79.54%(70/88)，在Luminal A型中表達最高，TNBC中表達最低，Luminal B型中表達高于HER2過表達型中的表達，4組總體比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；兩兩比較，僅在TNBC與其余各分子亞型中的表達之間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cyclin D1蛋白陽性表達率為60.22%(53/88)，在Luminal B型中表達最高，TNBC中表達最低，Luminal A型中表達高于HER2過表達型中的表達，4組總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；兩兩比較，僅在TNBC與Luminal A型、Luminal B型中的表達之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖2)。

表1AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌不同分子分型組織中的表達(n=88)

分子分型例數(shù)AR陽性數(shù)陽性率PCyclin D1陽性數(shù)陽性率PTNBC22836.40418.18Luminal A1616100.00?<0.0011168.75?<0.001Luminal B373697.30?3183.78?HER2過表達131076.92?753.85

*：與TNBC型比較，P<0.05。

A：AR蛋白陽性表達(×400)；B：Cyclin D1蛋白陽性表達(×400)。　　圖2　AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌組織中陽性表達

2.2AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌中的表達與臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)R蛋白在組織學(xué)I級中陽性表達率最高，III級中表達最低，總體比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；但僅在組織學(xué)III級與I、II級中的表達之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AR蛋白在臨床T1期中表達最高，T2期中表達最低，T4期中的表達高于T3期，總體比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但僅在T2期與T1期中的表達之間比較，差異有意義(P>0.05)。AR蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)。Cyclin D1蛋白在組織學(xué)II級中的表達最高，III級中表達最低，總體比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但僅在組織學(xué)III級與I、II級中的表達之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Cyclin D1蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期無關(guān)(P>0.05，見表2)。

表2AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌中的表達與臨床病理特征關(guān)系(n=88)

臨床病理特征例數(shù)AR陽性數(shù)陽性率(%)PCyclin D1陽性數(shù)陽性率(%)P組織學(xué)分級?、窦?313100.00★840561.54★?、蚣?74985.96★<0.00170.18★0.006?、蠹?8844.4427.78患者年齡(歲)　≤50453782.220.524272660.000.964　>50433376.7460.47腫瘤大小(cm)　<2352880.002425468.57　2～5333681.820.59256.820.338　>59666.6744.44淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移　有463780.430.829292463.040.572　無423378.5757.14臨床分期　T1262496.00◆16246761.54　T2422866.670.01857.140.839　T38787.5075.00　T4121191.6758.33

★：與組織學(xué)Ⅲ級比較，P<0.05；◆：與臨床T2期比較，P<0.05。

2.3非特殊型浸潤性乳腺癌組織中AR與Cyclin D1蛋白表達的相關(guān)性分析AR與Cyclin D1蛋白二者之間的表達呈正關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)強度是0.782(χ2=3.545，γ=0.782，P<0.001)，95%CI：[0.473，0.958](見表3)。

表3AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌組織中的表達的相關(guān)性分析(n=88)

ARCyclin D1+-P+4921<0.001-414

3　討論

隨著乳腺癌發(fā)病率上升及年輕化，已嚴重影響著我國女性的生命健康及生活質(zhì)量。乳腺癌的治療手段主要包括：手術(shù)、放療、化療及內(nèi)分泌治療，目前，乳腺癌的生物分子靶向治療已針對性應(yīng)用于臨床。所以，乳腺癌的分子分型結(jié)合發(fā)病機制、治療及預(yù)后的研究已成為熱點。

流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，遺傳、流產(chǎn)、肥胖和激素等是乳腺癌的高危因素，其中，長期高水平的雌激素與乳腺癌的發(fā)生更密切，因此，乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤。但隨著對乳腺癌發(fā)病機制的深入研究顯示，雄激素(androgen，A)及其受體(AR)對乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[9]。A是一種來源于女性卵巢和腎上腺皮質(zhì)的激素，通過與細胞質(zhì)中的AR結(jié)合，使AR被激活，促進細胞分化及增殖，發(fā)揮調(diào)控女性性腺的生長和發(fā)育的作用。研究表明，AR能促進ER陰性的乳腺癌細胞增殖；但在ER陽性的乳腺癌中，AR通過拮抗ER信號的生長刺激作用，從而發(fā)揮抗增殖作用。AR在超過三分之一的TNBC中有表達，運用藥物性AR阻斷劑比卡魯胺能有效抑制AR陽性的TNBC細胞的增殖，使腫瘤生長減慢，使患者的無進展生存期延長[10]。

屠世曄等[11]報道了239例乳腺癌患者中，AR在 Luminal A 型、Luminal B型及HER2過表達型乳腺癌中均呈過表達，而在TNBC中呈低表達。Gasparini等[12]指出，與ER陽性的乳腺癌比較，TNBC中AR表達更低，同時，AR的表達與腫瘤分級呈負相關(guān)。Hu等[13]對360例TNBC的研究發(fā)現(xiàn)，AR的表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，AR蛋白在Luminal A型中表達最高，在TNBC中表達最低；在組織學(xué)I級中表達最高，在III級中表達最低；在臨床T1期中表達高于在T2期中的表達；但與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。提示AR參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，其表達與不同分子分型有關(guān)。AR高表達則提示癌組織學(xué)分級較低，臨床分期較早，預(yù)后較好；AR表達下降，組織學(xué)分級增高，臨床分期越晚，預(yù)后越差。

細胞周期調(diào)節(jié)紊亂是乳腺癌發(fā)生最為重要的因素之一。Cyclin D1通過與CDK4/CDK6結(jié)合，調(diào)控抑癌基因蛋白pRb，激活轉(zhuǎn)錄，使細胞從G1期轉(zhuǎn)變到S期，從而推動細胞周期進程。研究顯示，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1 基因過表達和基因擴增，包括乳腺癌、膀胱癌、甲狀旁腺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌及細胞中心型淋巴瘤等[14]。

研究顯示，在乳腺癌組織中，Cyclin D1呈高表達，且與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目密切相關(guān)，其表達與ER表達呈正相關(guān)，與HER2表達呈負相關(guān)；Luminal A型乳腺癌所占比例較大；Cyclin D1陽性表達程度越高，患者生存時間越長[15]。王方等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1的表達與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，Cyclin D1蛋白在Luminal B型中表達最高，在TNBC中表達最低，在Luminal A型中表達高于在HER2過表達型中的表達；在組織學(xué)II級中表達最高，在III級中表達最低；其表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無關(guān)。提示在非特殊型浸潤性乳腺癌中，Cyclin D1蛋白的表達與腫瘤組織分子分型有關(guān)，還與腫瘤組織學(xué)分級有關(guān)。

研究顯示，在乳腺癌細胞中，雙氫睪酮激活后的AR通過DAX-1下調(diào)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄及表達，抑制乳腺癌細胞由G1期進入S期，抑制乳腺癌細胞增殖[17]。但也有研究認為，AR與 Cyclin D1蛋白可能通過同一調(diào)節(jié)途徑，刺激CDK4/6介導(dǎo)的Rb蛋白磷酸化，使Rb蛋白對癌細胞生長的抑制失活，導(dǎo)致正常生長的細胞發(fā)生異常增殖；在乳腺組織中，AR與 Cyclin D1蛋白共同參與基因突變，刺激乳腺良性上皮細胞異常增殖、甚至惡性轉(zhuǎn)化，促進乳腺癌的發(fā)生[18]。本實驗結(jié)果顯示，AR與Cyclin D1蛋白在TNBC中的表達均較在其余各分子亞型中的表達明顯減低，在組織學(xué)分級III級中表達均較在Ⅰ、Ⅱ級中的表達明顯減低，且AR與Cyclin D1蛋白二者間表達呈正關(guān)聯(lián)。推測AR蛋白過表達可能誘導(dǎo)Cyclin D1蛋白表達增加，從而促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；AR與Cyclin D1蛋白異常高表達是非特殊型浸潤性乳腺癌發(fā)生的早期事件。

綜上所述，AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌組織中的陽性表達均與分子分型及組織學(xué)分級有關(guān)，且均在TNBC、組織學(xué)III級癌組織中的表達最低；AR蛋白的表達還與臨床分期有關(guān)。聯(lián)合檢測AR與Cyclin D1蛋白在非特殊型浸潤性乳腺癌不同分子分型組織中的表達情況，可以作為指導(dǎo)臨床判斷腫瘤組織惡性程度、對患者進行個體化治療的生物學(xué)指標之一。