miR-581對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

全詩翠，夏榮木 ，胡　佳，鄧　飛

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點實驗室，貴州 遵義　563099；4.遵義市第一人民醫(yī)院 病理科，貴州 遵義　563000)

目前肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥疾病[1-3]。在肺癌患者中，約85%的患者組織學(xué)分型為非小細(xì)胞肺癌。大多患者的一線治療方案是手術(shù)切除，輔助以放化療及腫瘤免疫靶向治療[2]。microRNA是一類小分子非編碼雙鏈RNA，近年來的研究表明其對細(xì)胞的生長發(fā)育，分化以及其他生命活動中起到極為重要的作用[3]。大量研究表明microRNA對多種惡性腫瘤的生長、遷移和侵襲產(chǎn)生正性或負(fù)性影響。在肺癌相關(guān)的研究中，Gu等[4]的研究顯示miR-493能夠通過調(diào)節(jié)E2F1抑制肺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。Song等[5]的研究也表明miR-630能夠通過靶向作用于LMO3從而抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。其他的研究也顯示了相似的結(jié)果[6-10]。另外一些研究結(jié)果卻得出了相悖的結(jié)論。Ren等[11]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織中miR-92a的表達(dá)明顯高于周圍正常組織，并且這種高表達(dá)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)累及數(shù)目以及TNM分期呈正相關(guān)。并證實了miR-92a能夠通過靶向作用于PTEN從而促進非小細(xì)胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，同時也顯示miR-92a能夠促進肺癌的化療耐藥。Liang等[12]的研究則表明miR-26b上調(diào)或者下調(diào)都不能對肺癌H1299或者A549細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響，但是過表達(dá)miR-26b可能通過靶向作用于PTEN從而促進這兩種細(xì)胞的遷移以及降低化療敏感性。目前microRNA家族對肺癌作用尚有爭議，因此繼續(xù)尋找能夠抑制肺癌進展的microRNA分子將可能有益于肺癌患者病情的控制。miR-581是近年發(fā)現(xiàn)的一個microRNA分子。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)miR-581在肝癌組織中低表達(dá)，當(dāng)過表達(dá)miR-581時能夠促進肝癌HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg表達(dá)，同時也可以促進該細(xì)胞增殖。目前尚無研究表明miR-581在非小細(xì)胞肺癌的進展中具有相關(guān)作用，因此本實驗用非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞作為研究對象，探索miR-581與其之間的相互作用，為進一步研究miR-581對肺癌的治療效果提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司。miR-581以及miR-mimics由北京歐林格生物科技有限公司提供。miR-581-FAM購自廣州銳博科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX購自美國Thermo Fisher科技公司。CCK8檢測試劑盒由日本同仁公司提供。Transwell、基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組非小細(xì)胞肺癌株A549使用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37°C，5% CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h換液一次。當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%～90%時進行下一步操作。實驗設(shè)置陰性對照組、miR-mimics轉(zhuǎn)染組、miR-581轉(zhuǎn)染組。

1.3miR-581及miR-mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞A549細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)到80%～90%時，以每孔5×105個細(xì)胞的密度接種至6孔板中，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到50%～80%融合度時，用無血清培養(yǎng)饑餓細(xì)胞24 h，隨后按照RNAiMAX操作說明書配制工作液2 mL，處理6～8 h后，收集細(xì)胞，清洗后使用流式細(xì)胞儀進行檢測。激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為 510 nm。每次實驗重復(fù)3次。miR-581與miR-mimics轉(zhuǎn)染方案相同。

1.4CCK8法檢測細(xì)胞增殖變化肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)到80%～90%時，收集細(xì)胞，以每孔1×104個細(xì)胞的密度接種至96孔板中培養(yǎng)24 h后，使用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h，按照RNAiMAX操作說明書配制RNAiMAX-miR-581以及RNAiMAX-miR-mimics工作液，隨后轉(zhuǎn)染6～8h后，換液培養(yǎng)，每天同一時間取6個孔細(xì)胞進行檢測。實驗重復(fù)3次。最終以時間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)表示細(xì)胞增殖水平，繪制增殖曲線。

1.5克隆形成實驗A549細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)到50%～80%時進行轉(zhuǎn)染，收集細(xì)胞后，按照每孔1×103個細(xì)胞的密度接種至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h換液1次，連續(xù)培養(yǎng)1～2周，當(dāng)細(xì)胞克隆邊緣接觸時終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定30 min后用終濃度為0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，肉眼及顯微鏡下觀察克隆形成大小及數(shù)目。實驗重復(fù)3次。

1.6劃痕實驗肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)到80%～90%時，以每孔1×106個細(xì)胞的密度接種至6孔板中，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%融合度時進行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到100%時，使用1 mL的槍頭在孔中劃痕，確保劃痕寬度一致，線性良好。PBS洗掉破碎細(xì)胞后即在顯微鏡下觀察拍照，隨后每隔12 h觀察1次，拍照保存。當(dāng)對照組細(xì)胞劃痕融合后終止實驗。實驗重復(fù)3次。

1.7Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力遷移實驗：肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)到80%～90%時，以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種至24孔板中，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到50%～80%融合度時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，分別收集細(xì)胞。使用0.2 mL無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將之加入孔徑為8 μm的Transwell孔上腔，同時下腔加入600 μL的完全培養(yǎng)基，上下腔組裝完整后繼續(xù)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出上腔，用棉簽擦拭碳酸酯膜上壁未遷移的細(xì)胞。晾干后使用0.1%結(jié)晶紫對碳酸酯膜下壁已經(jīng)遷移的細(xì)胞進行染色15 min，取出后于倒置顯微鏡下，隨機選取中間及周圍上下左右5個視野觀察拍照，計數(shù)每個視野中細(xì)胞數(shù)目進行統(tǒng)計。實驗重復(fù)3次。

侵襲實驗：預(yù)先使用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基配置基質(zhì)膠工作液，使其終濃度為300～600 μg/mL，隨后向每個遷移小室中添加100 μL的基質(zhì)膠工作液，置于37°C培養(yǎng)箱中靜置1～2 h，基質(zhì)膠沉淀于小室底部。棄掉上清后，輕柔地向基質(zhì)膠上添加使用0.2 mL無血清培養(yǎng)基重懸的各組細(xì)胞，上下腔組裝完整后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后如上進行染色觀察計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1miR-581轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞的效率如圖1所示，陰性對照組細(xì)胞熒光強度為(0.3±0.09)%，miR-581轉(zhuǎn)染組熒光強度為(76.0±3.2)%，P<0.001。

***P<0.001。圖1　轉(zhuǎn)染miR-581進入肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

2.2CCK8法檢測肺癌A549細(xì)胞增值能力如表1所示，最終以時間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線后，可以觀察到在最初的2d內(nèi)，3組細(xì)胞的生長并沒有顯著差異(P>0.05)。從第3天開始，陰性對照組細(xì)胞(F=399.99)與miR-mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(F=293.99)的活性并沒有顯著差異(P>0.05)；但是miR-581轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(F=204.74)的增殖相對于陰性對照組細(xì)胞和miR-mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的活性則有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

組別OD450nm0d1d2d3d4d5d6d7d對照0.73±0.090.78±0.041.13±0.052.20±0.042.98±0.063.12±0.083.16±0.033.09±0.15miR-mimics 0.73±0.090.68±0.031.05±0.032.09±0.053.01±0.223.08±0.043.13±0.073.19±0.05miR-5810.73±0.090.68±0.021.02±0.021.74±0.06?#2.39±0.07?#2.38±0.06?#2.43±0.15?#2.43±0.08?#

*P<0.05,與對照組比較，#P<0.05,與miR-mimics組比較。

2.3克隆形成實驗如圖2所示，經(jīng)細(xì)胞結(jié)晶紫染色后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察顯示：陰性對照組與miR-mimics轉(zhuǎn)染組的平板內(nèi)細(xì)胞克隆數(shù)明顯多于miR-581轉(zhuǎn)染組。

A:Control;B:mimics;C:miR-581。圖2　轉(zhuǎn)染miR-581對肺癌A549細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4劃痕實驗如圖3所示，劃痕0 h時，劃痕寬度基本一致，培養(yǎng)24 h以及48 h后，陰性對照組與轉(zhuǎn)染miR-mimics組的細(xì)胞逐漸遷移至融合，劃痕寬度明顯變窄，轉(zhuǎn)染miR-581組細(xì)胞劃痕寬度變化不明顯。

圖3　劃痕實驗檢測miR-581對肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

2.5Transwell小室檢測A549細(xì)胞遷移能力變化如圖4所示，陰性對照組遷移細(xì)胞(387±14個)與miR-mimics轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞(380±24個)布滿整個視野(結(jié)晶紫染色)，miR-581轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞(229±18個)相對較少。高倍鏡下(20×10)隨機計數(shù)5個視野，計算每個視野平均細(xì)胞數(shù)目，miR-581轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)目相對于陰性對照組及miR-mimics轉(zhuǎn)染組數(shù)明顯減少(P<0.001)。

A：Control；B：miR-mimics；C：miR-581；***P<0.001。圖4　轉(zhuǎn)染miR-581對肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

2.6Transwell小室檢測A549細(xì)胞侵襲能力變化如圖5所示，陰性對照組(305±19個)與miR-mimics轉(zhuǎn)染組(315±12個)的侵襲細(xì)胞布滿整個視野， miR-581轉(zhuǎn)染組(137±13個)遷移細(xì)胞相對較少。高倍鏡下隨機計數(shù)5個視野，計算每個視野平均細(xì)胞數(shù)目， miR-581轉(zhuǎn)染miR-581組侵襲細(xì)胞數(shù)目相對于陰性對照組及miR-mimics轉(zhuǎn)染組明顯減少(P<0.0001)。

A：Control；B：miR-mimics；C：miR-581;***P<0.001。圖5　轉(zhuǎn)染miR-581對肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

3　討論

在本實驗中，我們采用多種方法探討對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系增殖、遷移和侵襲生物學(xué)行為的影響。通過CCK8法繪制A549細(xì)胞的生長曲線后，我們觀察到miR-581第3天開始，細(xì)胞的增殖開始受到抑制，當(dāng)細(xì)胞生長到達(dá)平臺期時，miR-581轉(zhuǎn)染組胞明顯少于陰性對照組及miR-mimics轉(zhuǎn)染組。同時克隆形成實驗也證實轉(zhuǎn)染miR-581的肺癌A549細(xì)胞克隆形成率降低。因此可以初步說明miR-581能夠抑制A549細(xì)胞的增殖。這與之前研究學(xué)者對其他miR分子如miRNA-493、miR-186、miRNAs-491-5p對非小細(xì)胞肺癌影響研究的結(jié)果相似[4,8-9]。此外，我們通過劃痕實驗以及Transwell遷移小室實驗證實轉(zhuǎn)染miR-581之后，肺癌A549細(xì)胞的遷移能力明顯降低。在Ma[14]和Li[15]等的研究中也有相似的結(jié)論。通過Transwell遷移小室預(yù)先鋪設(shè)基質(zhì)膠后，我們探索了miR-581對肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果證實，當(dāng)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-581后，侵襲能力相對于陰性對照組及miR-mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯降低。以上所有的結(jié)果提示，miR-581可能是肺癌治療的一個潛在的分子，值得我們作進一步的探索。

但是在本研究中，我們尚未進一步探索miR-581作用于A549細(xì)胞的具體機制。在先前的研究中，有大量證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞的增殖與大量基因相關(guān)。Orlando等[16]的研究表明，細(xì)胞內(nèi)p27 蛋白、p21蛋白以及 Cdks復(fù)合體等都與細(xì)胞的生長增殖和細(xì)胞周期相關(guān)，miR-581抑制A549細(xì)胞增殖是否與這些蛋白相關(guān)尚不知曉。此外，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)也是癌癥進展過程中重要的環(huán)節(jié)，它與癌癥的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移都高度相關(guān)[17-18]。我們的結(jié)果雖然表明miR-581能夠抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲，但是沒有深入研究其對EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響。其次，已有大量研究證明，多種microRNA分子能夠通過靶向作用于ZEB1[19]、ZEB2[20]和Twist1[21]等基因，從而調(diào)控特定腫瘤細(xì)胞的EMT過程。也有研究表明microRNA分子能夠通過調(diào)節(jié)PI3k/Akt/mTOR[22]，從而作用于下游基因，對EMT產(chǎn)生影響。所以miR-581抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲是否與這些基因相關(guān)，我們尚不清楚。最重要的是，目前尚無動物實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-581的A549細(xì)胞在異種移植進入活體動物體內(nèi)后也能夠產(chǎn)生同樣的效應(yīng)。

目前我們的結(jié)果初步證實miR-581能夠抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。但其在活體內(nèi)的效應(yīng)需要更進一步證實，具體機制也有待探索。