七氟烷麻醉對大鼠海馬CA3區(qū)ApoE4表達變化的影響

朱宇航，吳振宇，楊　洋，林夏妃，王　義，唐春春，朱昭瓊

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院　麻醉科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563099；3.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563002)

大腦海馬是人類以及哺乳動物與記憶能力密切相關的組織結構，其包含齒狀回、海馬體(CA1～CA4區(qū))、下托等幾部分。海馬體典型結構CA3區(qū)由大錐體細胞組成，主要參與空間辨別性學習記憶。人們如果出現(xiàn)空間記憶能力下降，輕則讓人產(chǎn)生心理憂慮，重則會嚴重影響人們的日常生活和工作，并對生理健康產(chǎn)生極大威脅，阿爾茨海默病便是突出代表。阿爾茨海默病對記憶功能影響的研究極為廣泛，學者們認為其主要病理改變是由于載脂蛋白E4基因型在腦內的過度表達所導致[1-2]，該發(fā)病機制在相關研究領域內的確切性和認同度較高。然而，記憶能力的下降是患者自身疾病所導致往往容易讓其接受，但如果由于醫(yī)療過程所引發(fā)，就很難被患者及家屬理解。在臨床工作中醫(yī)務工作者就常常遇到這樣一個現(xiàn)象，不少患者自訴在全麻術后的相當一段時間內出現(xiàn)了記憶能力的下降，而全身麻醉藥則被認為是“罪魁禍首”，常用吸入麻醉藥七氟烷作為全麻藥物家族的一份子儼然沒有逃脫同樣的質疑。故本研究模擬臨床，將成年雄性大鼠吸入3.2%七氟烷麻醉2 h，觀察蘇醒后2、24、72 h逃避潛伏期和海馬CA3區(qū)ApoE4蛋白表達變化，探討七氟烷麻醉對海馬CA3區(qū)ApoE4表達變化的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器Morris水迷宮系統(tǒng)(WMT-100)購自成都泰盟科技有限公司，麻醉機(Fabius)購自德國Drager公司；氣體監(jiān)護儀(Vamos)購自德國Drager公司；激光共聚焦顯微鏡(SP2)購自德國Leica公司；七氟烷(批號：65120501) 購自山東魯南貝特制藥有限公司；ApoE4兔多抗(一抗)購自北京博奧森生物技術有限公司；FITC羊抗兔(二抗)購自北京索萊寶科技有限公司；DAPI購自美國Vector公司。

1.2實驗動物SPF級健康雄性成年SD大鼠60只，體重300～400 g，15周齡，由四川成都達碩生物科技有限公司提供(許可證號：SCXK(111)2008-24)。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠5只。依照嚙齒類動物飼養(yǎng)標準，干燥飼料喂食，自由飲水。環(huán)境溫度26±2 ℃，濕度40%～60%，依照自然習慣變化日光燈照射。

1.3方法

1.3.1行為學測試將所有大鼠進行單次120s游泳訓練，排除不會游泳大鼠，隨后進行連續(xù)4 d定位航行實驗。定位航行實驗：在采集記錄系統(tǒng)中將水迷宮劃分為4個象限，在水迷宮池壁45°、135°、225°、315°位置設定為入水點，第2象限內擺放隱匿平臺并在系統(tǒng)中設定平臺區(qū)域，大鼠依次分別從各入水點面向池壁入水，系統(tǒng)記錄大鼠入水后至尋找到平臺時間即為逃避潛伏期，120 s未尋找到平臺的，時間記錄為120 s，并引導大鼠上平臺休息20 s。在麻醉后2、24、72 h再次行定位航行實驗，并記錄逃避潛伏期。

1.3.2實驗動物分組采用大鼠d4逃避潛伏期時間，按隨機數(shù)字表分成兩個大組：實驗組Test組(簡稱T組，n=30)；對照組Control組(簡稱C組，n=30)。依麻醉蘇醒后2、24、72 h 3個不同實驗時間，將T組、C組各等分成3個亞組(T2組、T24組、T72組、C2組、C24組、C72組，n=10)。

1.3.3麻醉處理密閉吸入麻醉箱兩側開孔分別接麻醉機進、出氣螺紋管和氣體監(jiān)護儀，箱底鋪墊1 cm鈣石灰。實驗組調節(jié)氧流量1.5 L/min+空氣流量2.5 L/min，開放七氟烷揮發(fā)罐行箱內氣體平衡，待進、出氣口七氟烷濃度達3.2%時放入大鼠，大鼠夾尾反射、翻正反射消失后，認定大鼠進入麻醉狀態(tài)，開始計時，麻醉時間2 h，進行性觀察大鼠口唇顏色及呼吸運動幅度；對照組大鼠吸入氧氣1.5 L/min+空氣2.5 L/min共2 h。麻醉完成后，取出箱內大鼠，擺放至自然環(huán)境中，待其自然蘇醒。

1.3.4取材及標本制備在麻醉蘇醒后2、24、72 h進行取材，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，剝離完整大腦組織，冰鹽水迅速清洗腦組織，切除視神經(jīng)以前的額葉部分、枕葉、紋狀體部分，置于4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h后以冠狀面平行切面方向進行石蠟包埋。將包埋后的蠟塊在切片機上平行大腦冠狀面切成3 μm的切片，粘附于經(jīng)多聚賴氨酸預處理的載玻片上，置于65 ℃的恒溫箱內烘烤2 h。病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次，每次20 min。隨后依次100%、95%、85%、70%、50%乙醇梯度復水，各5 min，雙蒸水復水2次，每次10 min。PBS洗片3次，每次5 min。抗原修復：將PH 6.0的檸檬酸在高壓鍋內加熱至沸騰，放入病理切片完全浸沒與檸檬酸溶液下，加蓋繼續(xù)加熱至高壓鍋噴汽3 min，快速放氣，冷水沖洗高壓鍋冷卻10 min，打開高壓鍋蓋自然冷卻30 min至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min，輕輕甩去標本表面PBS。每張切片以10%牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum ,BSA)10 μL涂片封閉30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，濾紙擦去標本外的PBS。每張切片標本處滴加10 μL一抗(ApoE4兔多抗，以10%BSA 按1∶20稀釋)，4 ℃孵育過夜，陰性對照同法滴加等量PBS。次日取出切片室溫復溫1 h，PBS浸泡清洗3次，每次5 min，輕輕甩去標本表面PBS。避光環(huán)境中每張切片標本處滴加10 μL熒光二抗(FITC羊抗兔，以10%BSA 按1∶8稀釋)，室溫下孵育2 h，PBS浸泡洗片3次，每次5 min，濾紙擦去標本外的PBS。避光環(huán)境中每張切片滴加DAPI 10 μL，蓋玻片封片。

1.3.5激光共聚焦顯微鏡觀察海馬CA3區(qū)ApoE4表達將染色后的切片放于激光共聚焦倒置顯微鏡下，20倍物鏡觀察海馬形態(tài)尋找目標觀察區(qū)，將視野移至目標觀察區(qū)域后切換為40倍物鏡并轉換至掃描成像，選擇激發(fā)光波長488 nm掃描陰性對照片，以照陰性對照參數(shù)為基線，分別對陽性觀察切片進行掃描和采集圖片，用LCS Lite軟件進行光密度分析，每個腦標本取5～10張切片，每張切片取5個視野計算平均值。

2　結果

在單次適應性訓練中未發(fā)現(xiàn)不會游泳及先天愚型大鼠。麻醉過程中無大鼠發(fā)生青紫、發(fā)紺、呼吸抑制及死亡。

2.1麻醉前定位航行實驗結果顯示，與d1比較，d2、d3、d4差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，d2、d3、d4間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1)。

#：與第1天比較：P<0.05。圖1　大鼠麻醉前逃避潛伏期變化趨勢

2.2麻醉蘇醒后2、24、72 h定位航行實驗逃避潛伏期結果，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

組別蘇醒后2h蘇醒后24h蘇醒后72hT12.3±3.213.0±7.714.8±4.4C12.6±5.812.2±10.311.7±3.8

2.3經(jīng)DAPI染色切片在共聚焦顯微鏡下見核仁清晰，定位準確，陰性對照切片在視野中無細胞顯影(見圖2)。

A：DAPI染色定位圖像；B：陰性切片掃描圖像；共聚焦10×40。圖2　海馬CA3區(qū)DAPI定位及陰性對照免疫熒光結果

2.4麻醉蘇醒后2 h，兩組大鼠海馬CA3區(qū)ApoE4熒光檢測圖像(見圖3)，T2組平均光密度為75.4±25.6，C2組平均光密度為61.9±12.9，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A：T組蘇醒后2 h圖像；B：C組蘇醒后2 h圖像；共聚焦10×40。圖3　兩組大鼠蘇醒后2 h海馬CA3區(qū)免疫熒光結果

2.5麻醉蘇醒后24 h，兩組大鼠海馬CA3區(qū)ApoE4熒光檢測圖像(見圖4)，T24組平均光密度為85.3±35.5，C24組平均光密度為65.3±19.9，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A：T組蘇醒后24 h熒光掃描圖像；B：C組蘇醒后24 h熒光掃描圖像；共聚焦10×40。圖4　兩組大鼠蘇醒后24 h海馬CA3區(qū)免疫熒光結果

2.6麻醉蘇醒后72 h，兩組大鼠海馬CA3區(qū)E4熒光檢測圖像(見圖5)，T72組平均光密度為85.4±24.0，C72組平均光密度為65.3±18.9，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A：T組蘇醒后72 h熒光掃描圖像；B：C組蘇醒后72 h熒光掃描圖像；共聚焦10×40。圖5　兩組大鼠蘇醒后72 h海馬CA3區(qū)免疫熒光結果

2.7T組蘇醒后24、72 h與蘇醒后2 h比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，蘇醒后24 h與72 h之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C組不同時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具體(見表2)。

組別蘇醒后2h蘇醒后24 h蘇醒后72hT 75.4±25.6#85.3±35.5#?85.4±4.0#?C 61.9±12.965.3±19.965.3±18.9

#：與C組比較：P<0.01；*：與蘇醒后2 h比較P<0.05。

3　討論

七氟烷是新型臨床常用吸入麻醉藥，但七氟烷麻醉出現(xiàn)可逆性認知功能障礙的報道卻時有發(fā)生[3-4]。七氟烷麻醉后有可能減少海馬神經(jīng)元生長，引發(fā)大鼠神經(jīng)毒性和認知功能障礙的發(fā)生[5]?，F(xiàn)有研究中發(fā)現(xiàn)，β淀粉樣蛋白的異常沉積與癡呆樣改變有著密切的關系[6]。載脂蛋白E主要在肝臟和腦內合成，其包含了ApoE2、ApoE3、ApoE4三種等位基因，ApoE3最為常見，但是ApoE4更易與β淀粉樣蛋白結合形成Aβ-ApoE4復合物，進而加重神經(jīng)元纖維纏結的增加[7]。張雪梅等[8]認為，ApoE4可以使β淀粉樣蛋白前體蛋白APP770的mRNA水平提升近9倍，有促進細胞凋亡的作用。國內外大量阿爾茨海默病的機制研究中證實，ApoE4作為β淀粉樣蛋白凝集的啟動子，增強了認知功能障礙發(fā)生的風險[9-10]。

由于年齡是認知功能障礙發(fā)生的高危因素，故本實驗采用了生命周期中生理機能較為旺盛及穩(wěn)定的成年雄性大鼠作為研究對象，同時避免了雌激素水平的干擾。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，成年大鼠單純吸入3.2%(約1.3MAC)濃度的七氟烷麻醉后可使海馬CA3區(qū)ApoE4表達上調，麻醉蘇醒后的24h和72 h小時較蘇醒后2 h增高的更為明顯。本實驗行為學指標中逃避潛伏期所反映的是大鼠陳述性記憶能力，基礎陳述性記憶能力的形成是大鼠麻醉前一天，在七氟烷麻醉后的72 h內兩組大鼠的陳述性記憶能力并無差異，由于實驗中未做大鼠麻醉前后自身行為學結果對照，因此并不能說明麻醉藥物的作用不影響行為學變化，這也是本研究的不足之處。并且經(jīng)過七氟烷麻醉是否影響遠期陳述性記憶能力，甚至是否會對老年期大鼠產(chǎn)生影響將是未來的研究目標。研究結果提示：七氟烷麻醉后雖未影響生理周期旺盛的成年雄性大鼠的近期陳述性記憶能力，但引發(fā)海馬CA3區(qū)ApoE4表達上調仍不排除是引發(fā)術后認知功能障礙的風險因素之一，尤其是對家族遺傳性ApoE4基因型高表達的患者我們更應加強關注，做好圍術期合理用藥選擇，以規(guī)避由七氟烷麻醉而引發(fā)的術后認知功能障礙的風險。并期盼在進一步研究中去深入探討相關機制，為更好的指導臨床診治提供理論依據(jù)。

綜上所述，成年雄性大鼠經(jīng)3.2%七氟烷吸入麻醉2 h后，使海馬CA3區(qū)ApoE4表達持續(xù)增高至少72 h，可能是患者術后一定時間內記憶力下降的誘發(fā)機制之一。