基因沉默LMTK3對甲狀腺乳頭狀癌細胞株BCPAP惡性生物學(xué)行為的影響

泮紅飛，馮繼紅，楊濤羽，蘇　俊，劉芊伊，劉旭恒，龍潤瑩，殷　茜，羅軍敏

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義　563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義　563099; 3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤科，貴州 遵義　563099；4.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義　563099)

甲狀腺癌(Thyroid Cancer,TC)是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，近年已成為發(fā)病率增速最快的惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary Thyroid Cancer,PTC)是甲狀腺癌最常見的一種，約占80%。手術(shù)、化療及I131放療等治療手段雖已取得較明顯的臨床療效，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致PTC患者死亡的主要原因[2-3]。因此，進一步揭示PTC細胞惡性生物學(xué)行為變化的規(guī)律及相關(guān)的驅(qū)動機制，對有效控制PTC患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及延長總生存期具有重要臨床價值。狐猴酪氨酸激酶3(The lemur tyrosine kinase 3,LMTK3)是絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶家族(Serine-threonine-tyrosine kinase family)的重要成員。多項研究已表明，LMTK3在多種惡性腫瘤組織及血清中高表達，干預(yù)其基因表達可導(dǎo)致腫瘤細胞相關(guān)惡性生物學(xué)行為的改變。迄今為止，有關(guān)LMTK3與PTC相關(guān)性的研究僅限于組織和血清層面，尚未見針對PTC細胞的報道。本研究以PTC細胞模型BCPAP為研究對象，應(yīng)用基因沉默LMTK3的慢病毒載體感染BCPAP細胞后探討其增殖、遷移、侵襲及凋亡等惡性生物學(xué)行為的改變情況，從而在細胞水平初步闡明LMTK3的生物學(xué)功能，為甲狀腺乳頭狀癌靶向治療的靶點選擇提供新依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器人甲狀腺乳頭狀癌細胞株BCPAP購自中科院上海細胞庫；胎牛血清和1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；含shLMTK3的重組慢病毒載體由OBiO公司包被完成；LMTK3兔抗人多克隆抗體購自Lifespan公司；過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體、過氧化物酶標(biāo)記的驢抗小鼠多克隆抗體購自Proteintech公司；β-actin小鼠抗人單克隆抗體來自Cell Signaling Technology公司；全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL發(fā)光液均購自碧云天公司；Matrigel膠和流式凋亡檢測試劑盒購自BD公司；CCK8試劑購自日本同仁公司；Transwell小室購自美國Corning公司；TE2000-S型倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon株式會社；無菌操作臺和細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；流式細胞計數(shù)儀FACS Calibur購自美國Becton- Dickinson公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和慢病毒感染人甲狀腺乳頭狀癌細胞BCPAP培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃飽和濕度。將處于對數(shù)生長期的BCPAP細胞接種于6孔板中，待細胞融合至70%左右時，進行慢病毒感染。分為五組：以沉默LMTK3的重組慢病毒載體(LV-shLMTK3)的3個序列(分別為LV-shLMTK3-1、LV-shLMTK3-2和LV-shLMTK3-3)和對照慢病毒載體(LV-Control)分別感染人甲狀腺乳頭狀癌細胞BCPAP，作為實驗組(LV-shLMTK3)和陰性對照組(LV-Control)，空白對照組的細胞不做任何處理。感染條件：每孔1 mL培養(yǎng)基，10%胎牛血清，6×106TU/mL的病毒液，polybrene 5 μg/mL，10 h時換成2 mL無血清培養(yǎng)基，72 h時換為完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察細胞的感染效率。

1.2.2Western blot方法檢測細胞中LMTK3的表達用Lysis Buffer裂解、提取上述五組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。將蛋白置于10% SDS-PAGE凝膠中電泳分離，轉(zhuǎn)膜40 min，5% BSA封閉50 min后，加入β-actin小鼠抗人單克隆抗體(1∶1 500)和LMTK3兔抗人多克隆抗體(1∶500)，4 ℃孵育12 h，漂洗，再加過氧化物酶標(biāo)記的驢抗小鼠多克隆抗體和過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體(1∶800)，20 ℃孵育1.5 h后滴加發(fā)光試劑，于暗室曝光條帶。每組3個復(fù)孔，取平均數(shù)。實驗重復(fù)3次。從LV-shLMTK3-1、LV-shLMTK3-2和LV-shLMTK3-3三個實驗組中選擇沉默效果最佳的一組代表實驗組，與LV-Control組組合進行后續(xù)實驗。

1.2.3CCK8法檢測沉默效果最佳的LV-shLMTK3組和LV-Control組細胞增殖能力的變化取上述沉默效果最佳的LV-shLMTK3組和LV-Control組處于對數(shù)生長期的細胞，以5×103/100 μL/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h和120 h時，加入10 μL的CCK8試劑繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測各孔吸光度值。每組3個復(fù)孔，取平均數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4Transwell實驗檢測沉默效果最佳的LV-shLMTK3組和LV-Control組細胞的遷移和侵襲能力的變化Transwell小室置于24孔板中，無血清培養(yǎng)液和液態(tài)基質(zhì)膠7∶1混合，取60 μL鋪于每個Transwell上室(6個Transwell上室加基質(zhì)膠做侵襲實驗，6個Transwell上室不加基質(zhì)膠做遷移實驗)，5% CO2、37 ℃條件下孵育2 h，棄上層無血清培養(yǎng)液。兩組處于對數(shù)生長期的細胞均稀釋至6×104/mL，12個上室加200 μL細胞懸液，對應(yīng)的12個下室加600 μL含15% FBS的培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，棉簽輕擦上室細胞，PBS沖洗4次，10%多聚甲醛固定20 min，自然晾干。加0.1%的結(jié)晶紫溶液染色小室20 min，PBS沖洗多余染料。在倒置顯微鏡下隨機計數(shù)3個細胞視野，計數(shù)下室面的細胞數(shù)即為穿膜細胞數(shù)，取平均數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測沉默效果最佳的LV-shLMTK3組和LV-Control組細胞的凋亡率的變化將沉默效果最佳的LV-shLMTK3組和LV-Control組處于對數(shù)生長期的細胞以6×106/2 mL/孔接種于6孔板中，5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。細胞生長融合至90%時，PBS洗滌細胞3次，用不含EDTA的胰酶消化，經(jīng)1 000 r/min離心10 min，冷PBS洗滌細胞沉淀1次，1 000 r/min離心10 min，洗滌細胞，加入300 μL染色緩沖液重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育20 min，加入5 μL PI，1 h內(nèi)上機檢測。每組3個復(fù)孔，取平均數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用Image J和Graphpad prism 5.0軟件進行分析，兩組樣本比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1BCPAP細胞被慢病毒載體感染后顯微鏡下觀察其被感染的效果慢病毒顆粒感染BCPAP細胞48 h后，于倒置熒光顯微鏡下判斷感染效果。發(fā)現(xiàn)5組細胞熒光感染率均達到80%以上(見圖1)。

3個基因沉默序列的慢病毒感染效果類似，因此只呈現(xiàn)了一組作為代表?！　D1　慢病毒質(zhì)粒感染BCPAP細胞的熒光表達情況(SP×100)

2.2檢測LMTK3在五組細胞中的表達Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LV-shLMTK3組細胞LMTK3蛋白的表達水平明顯低于LV-Control組細胞的蛋白表達水平(P<0.05)，特別是LV-shLMTK3-3組差異更顯著(P<0.01)，而陰性對照組和空白對照組間無明顯差異性(見表1，圖2)。實驗結(jié)果表明，基因沉默LMTK3的慢病毒細胞株構(gòu)建成功，后續(xù)實驗采用LV-shLMTK3-3作為實驗組。

表1Western Blot方法檢測三組細胞的OD值

實驗結(jié)果ControlLV-ControlLV-shLMTK3.1LV-shLMTK3.2LV-shLMTK3.3第1次實驗結(jié)果的平均值1.0730.6970.4890.3740.265第2次實驗結(jié)果的平均值0.9940.9550.6210.4050.364第3次實驗結(jié)果的平均值0.9321.0570.5720.5860.342總實驗結(jié)果(x±s) 1.000 ±0.0710.903±0.1860.561±0.0660.455±0.1140.324±0.052

與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖2　Western blot檢測LMTK3在BCPAP細胞中的表達

2.3基因沉默LMTK3表達對BCPAP細胞增殖能力的影響CCK8實驗檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)24 h時，LV-shLMTK3-3組和LV-Control組細胞間的增殖速度無明顯差異(P>0.05)；從48 h開始，LV-shLMTK3-3組細胞的增殖速度均明顯低于LV-Control組細胞的增殖速度(分別為P<0.01,P<0.001,P<0.001和P<0.001，見表2，圖3)。實驗結(jié)果表明，基因沉默LMTK3能夠顯著抑制BCPAP細胞的增殖能力。

組別24 h48 h72 h96 h120 hLV-Control0.991±0.0121.246±0.0291.667±0.0831.834±0.0851.846±0.077LV-shLMTK3-30.978±0.0261.144±0.0221.211±0.1211.245±0.0541.378±0.034

與對照組比較，**P<0.01,***P<0.001。圖3　基因沉默LMTK3對BCPAP細胞增殖能力的影響

2.4基因沉默LMTK3表達對BCPAP細胞遷移和侵襲能力的影響Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)48 h時，LV-shLMTK3-3組細胞的遷移(見表3，圖4)和侵襲(見表4，圖5)能力分別明顯低于LV-Control組細胞的遷移和侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。實驗結(jié)果表明，基因沉默LMTK3能夠顯著抑制BCPAP細胞的遷移和侵襲能力。

表3Transwell遷移實驗檢測兩組細胞的遷移能力(n=3)

組別第1次實驗結(jié)果的平均值第2次實驗結(jié)果的平均值第3次實驗結(jié)果的平均值總實驗結(jié)果(x±s)LV-Control1.0491.0140.9371.00±0.06LV-shLMTK3-30.5070.4200.2970.41±0.11

所有數(shù)據(jù)均進行過歸一化處理，即所有值分別除以Control的平均值。

與對照組比較，**P<0.01。圖4　基因沉默LMTK3對BCPAP細胞遷移的影響(SP×40)

2.5基因沉默LMTK3表達對BCPAP細胞凋亡率的影響通過流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)48 h時的細胞，我們發(fā)現(xiàn)LV-shLMTK3-3組細胞的凋亡率均明顯高于LV-Control組細胞的凋亡率(P<0.01)(見表5，圖6)。實驗結(jié)果表明，基因沉默LMTK3能夠顯著促進BCPAP細胞的凋亡率。

表4Transwell侵襲實驗檢測兩組細胞的侵襲能力(n=3)

組別第1次實驗結(jié)果的平均值第2次實驗結(jié)果的平均值第3次實驗結(jié)果的平均值總實驗結(jié)果(x±s)LV-Control1.0680.8531.0801.00±0.13LV-shLMTK3-30.5860.4340.5540.52±0.08

所有數(shù)據(jù)均進行過歸一化處理，即所有值分別除以Control的平均值。

與對照組比較，**P<0.01。圖5　基因沉默LMTK3對BCPAP細胞侵襲的影響(SP×40)

表5流式細胞術(shù)檢測兩組細胞的凋亡率(%,n=3)

組別第1次實驗結(jié)果的平均值第2次實驗結(jié)果的平均值第3次實驗結(jié)果的平均值總實驗結(jié)果(x±s)LV-Control10.387.339.809.17±1.62LV-shLMTK3-317.6620.5423.8220.67±3.08

凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。與對照組比較，**P<0.01。圖6　基因沉默LMTK3對BCPAP細胞凋亡的影響

3　討論

據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，2017年美國甲狀腺癌(TC)新發(fā)病例5 399萬例，死亡病例206萬例，其中女性TC患者的發(fā)生率約為男性患者的3倍，死亡率無明顯性別差異[1]。甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的發(fā)生率也存在上述性別差異[4]，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達50%以上[2]，局部復(fù)發(fā)率高達34.6%[3]。因此，控制TC患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移可有效降低死亡率。多項研究提示，與甲狀腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物已成為目前TC研究的熱點。

絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶家族的成員包括LMTK1、LMTK2和LMTK3，人類LMTK3基因位于19q13.33，是一類在人體內(nèi)廣泛表達的單次跨膜蛋白，在大腦皮質(zhì)、小腦、乳腺、肺、胃及結(jié)直腸中的表達量較高[5]。研究表明，LMTK3在甲狀腺癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]、結(jié)直腸癌[10]和慢性中性粒細胞白血病[11]等多種人類惡性腫瘤組織或血清中均高表達，而在前列腺癌[12]組織中低表達，目前LMTK3對乳腺癌細胞生物學(xué)行為影響的研究最多。Mackiewicz等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過下調(diào)ER的活性和AKT信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖和周期進程，而LMTK3是miR-34a的靶點[14]；Giamas等[15]證明，沉默LMTK3可顯著抑制ERα陽性乳腺癌細胞的增殖和裸鼠種植瘤的生長，LMTK3能直接或通過PKC-AKT-FOXO3信號通路間接磷酸化ERα，在mRNA和蛋白兩個層面保護ERα的含量和活性，導(dǎo)致對他莫昔芬的耐藥[14]；Stebbing等[16]驗證LMTK3通過c-MYC、HSPB8和SIAH2等多種機制參與了乳腺癌患者對他莫昔芬的原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。LMTK3除了通過ERα信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能，還可依靠非ER信號通路影響腫瘤的惡性生物學(xué)行為，如：LMTK3與生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,GRB2)相互作用能促進乳腺癌細胞的侵襲、遷移和抑制凋亡，而阻斷GRB2能產(chǎn)生相反的作用[17-19]；LMTK3可通過與KAP1結(jié)合增強PP1α的活性來抑制乳腺癌細胞中部分腫瘤抑制樣基因的表達[20]。此外，朱文等[21]發(fā)現(xiàn)下調(diào)LMTK3可顯著抑制A549細胞的增殖、遷移和周期進展；Sun等[12]報道LMTK3在體內(nèi)外均能抑制前列腺癌細胞的生長、遷移和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡，并能抑制AKT和ERK的磷酸化，促進p38激酶和JNK激酶的磷酸化和激活。在非小細胞肺癌[8]、胃癌[9]和結(jié)直腸癌[10]中，LMTK3作為一種致癌因子，與臨床病理資料還存在顯著的相關(guān)性。由此推斷，LMTK3能夠在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

Lu等[6]發(fā)現(xiàn)LMTK3在TC血清中的表達水平與臨床分期和病理類型有關(guān)，基因水平敲減LMTK3可顯著抑制人甲狀腺鱗癌SW579細胞的增殖、侵襲和遷移，同時可促進其凋亡。本課題組前期研究[22]發(fā)現(xiàn)LMTK3在PTC患者甲狀腺組織中的表達水平與其臨床分期和ERα的含量正相關(guān)。為此，本研究通過構(gòu)建針對LMTK3的重組慢病毒載體(LV-shLMTK3)，分組感染BCPAP細胞株，觀察基因沉默LMTK3對細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)慢病毒顆粒能夠高效感染BCPAP細胞株，被LV-shLMTK3慢病毒感染的BCPAP細胞株中LMTK3蛋白的表達量很低(P<0.01)。進一步的研究顯示，基因沉默LMTK3能顯著抑制BCPAP細胞的增殖(P<0.001)、遷移(P<0.01)和侵襲(P<0.01)能力，且能明顯促進其凋亡(P<0.01)。上述結(jié)果提示LMTK3可能作為甲狀腺乳頭狀癌的一個新的致癌基因，為甲狀腺乳頭狀癌的靶向基因治療提供了新視角。結(jié)合文獻報道，PI3K/AKT、GSK3-β和mTOR等信號分子對于調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和分化具有重要作用，Bcl-2蛋白家族和Caspase-3信號分子在細胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[23]，上皮來源腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化也常伴有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)進程的改變[24]。至于LMTK3是否通過上述分子調(diào)節(jié)BCPAP細胞的增殖和凋亡，是否通過調(diào)節(jié)EMT進程來促進BCPAP細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，以及LMTK3在腫瘤細胞與其微環(huán)境中所扮演的角色尚未知，仍亟待深入探究。因此，本課題組將在后續(xù)實驗中采用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測相關(guān)因子的表達及通過相關(guān)體內(nèi)實驗進一步探討LMTK3在甲狀腺乳頭狀癌細胞中的具體作用機制。由此認為，LMTK3參與甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學(xué)行為的具體分子機制有望成為一個新的研究思路。

綜上所述，LMTK3可在人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，可能是促進PTC發(fā)生發(fā)展的重要分子。本研究初步證實了基因沉默LMTK3能夠抑制人BCPAP細胞的增殖、遷移及侵襲能力，促進其凋亡，可為進一步研究LMTK3對PTC惡性生物學(xué)行為影響的分子調(diào)控機制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。