白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的實驗研究

李金貴，劉　川，萬　華 ，吳　克，翟　超，黃　飚

(1.成都天府新區(qū)人民醫(yī)院 泌尿外科，四川 成都　610213；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 泌尿外科，重慶　400010)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病率上升并呈年輕化的趨勢[1]。目前，臨床上治療前列腺癌多采用外科手術(shù)聯(lián)合全身放療法，但存在價格昂貴、風(fēng)險性高、易耐受、毒副作用大等劣勢，且研究發(fā)現(xiàn)，放療法對于前列腺癌患者5年生存率并沒有顯著影響[2]。因而，從毒小價優(yōu)的天然產(chǎn)物中尋找一種能有效抑制前列腺癌疾病進(jìn)展的活性成分具有重要的現(xiàn)實意義。白藜蘆醇是一種生物活性很強的天然多酚類物質(zhì)，存在于桑樹、花生、藜蘆、朝鮮槐等多種植物中，具有抗氧化、抗微生物和抗炎等功效[3]。研究表明，白藜蘆醇對體外培養(yǎng)的多種人類腫瘤細(xì)胞均存在一定的抑制作用，如肝癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等[4-5]。本研究以前列腺癌PC-3細(xì)胞為研究對象，探討白藜蘆醇對其凋亡的影響，并探討其潛在機(jī)制，為揭示白藜蘆醇的抗腫瘤活性及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥品白藜蘆醇購于中國藥品生物制品檢定所，加入二甲基亞砜溶解至濃度為1 mol/L作為母液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，避光保存于4 ℃冰箱中，于使用前用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至各工作濃度。

1.2細(xì)胞株前列腺癌PC-3細(xì)胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司，所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，每隔2～3 d胰酶消化并傳代，定時更換培養(yǎng)液。

1.3試劑與主要儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；MTT粉末、Hoechst 33258染液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9一抗購自美國CST公司；RIPA裂解液、Trizol提取液、BCA試劑盒、PVDF膜均購自美國Thermo公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；SYBR MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；超微量核酸蛋白測定儀購自英國BioDrop公司；高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)購自美國PerkinElmer公司；電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱、MK3型酶標(biāo)儀、實時熒光定量PCR儀均購自美國Thermo公司。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個/L，每孔100 μL分別接種于兩塊96孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液。分別配制終濃度為0(對照組)、15、30、60、90 μmol/L的白藜蘆醇溶液，每孔加入100 μL，同時設(shè)置空白組，除不加細(xì)胞懸液外其余同藥物組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT液10 μL，避光孵育4 h后，每孔加入DMSO液150 μL，室溫下振蕩10 min，然后于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔的吸光度值(A值)，并計算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率/%=(A藥物組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.5Hoechst 33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡情況前列腺癌PC-3細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個/L接種至96孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別加入0、15、30、60、90 μmol/L的白藜蘆醇溶液100 μL，每組設(shè)置6個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，于37 ℃避光孵育30 min；孵育完成后，棄去孔內(nèi)染液，PBS洗2次后，采用高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.6Western-blotting法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×108個/L，以每孔1.5 mL接種至6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別加入0、15、30、60、90 μmol/L的白藜蘆醇溶液100 μL干預(yù)24 h。藥物干預(yù)完成后棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入1 mL RIPA液裂解細(xì)胞，收集于EP管中，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液制備細(xì)胞蛋白提取液，BCA試劑盒法測定細(xì)胞總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍(lán)跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗(Bax，1：500；Bcl-2，1∶1 000；Caspase-3，1∶1 000；Caspase-9，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后進(jìn)行ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應(yīng)灰度值的比值計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.7RT-PCR檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)細(xì)胞處理及藥物干預(yù)方法同1.6。干預(yù)完成后棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入一定量Trizol試劑提取組織總RNA，檢測含量合格后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9基因產(chǎn)物，以β-actin基因為內(nèi)參。引物由深圳華大基因公司合成，序列(見表1)。

表1基因引物序列

基因基因序列(5’-3’)擴(kuò)增長度(bp)Bax上游GTTTCATCCAGGATCGAGC138下游GATCATCCTCTGCAGCTCCBcl-2上游TGTGTGGAGAGCGTCAACAG237下游TCCACAAAGGCGTCCCAGCCaspase-3上游AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG179下游GAACCATGACCCGTCCCTTGCaspase-9上游GCAAGACAACTCGAGCCTG134下游CATTCTTCTCTCTGTGCTTGATCGβ-actin上游CATCCTGCGTCTGGACCTGG159下游TAATGTCACGCACGATTTCC

2　結(jié)果

2.1白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖抑制率的影響與對照組相比，不同濃度的白藜蘆醇干預(yù)前列腺癌PC-3細(xì)胞24 h、48 h后，細(xì)胞增殖水平均受到不同程度的抑制，且劑量從15 μmol/L起即有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。同時，白藜蘆醇對該細(xì)胞的增殖抑制率呈明顯的劑量依賴性，但同濃度下藥物干預(yù)48 h與干預(yù)24 h比較，并沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，見表2)。

2.2白藜蘆醇對前列腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響Hoechst 33258熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組前列腺癌系PC-3細(xì)胞發(fā)出均勻的藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，熒光呈暗色，說明無明顯的凋亡特征；在白藜蘆醇干預(yù)細(xì)胞24 h后，隨著藥物干預(yù)濃度的增加，同一視野下細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞透亮，部分細(xì)胞核碎裂，核固縮，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征(見圖1)。

白藜蘆醇濃度(μmol/L)干預(yù)24 h(%)干預(yù)48 h(%)0(對照組)001511.7±1.5?17.2±2.2?3022.4±3.1??27.5±3.8??6043.7±5.2??42.4±6.8??9048.6±7.1??48.9±7.0??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

A：對照組；B：15 μmol/L組；C：30 μmol/L組；D：60 μmol/L組；E：90 μmol/L組。圖1　不同濃度白藜蘆醇對前列腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響(×100)

2.3白藜蘆醇對前列腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，白藜蘆醇干預(yù)24 h后，前列腺癌系PC-3細(xì)胞促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)均顯著上升(P<0.05或P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下降(P<0.05或P<0.01)，Bax/Bcl-2比例顯著上升(P<0.05或P<0.01)，均呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性(見圖2，表3)。

圖2　各組前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

白藜蘆醇(μmol/L)BaxBcl-2Bax/Bcl-2Caspase-3Caspase-90(對照組)0.13±0.020.51±0.080.36±0.040.18±0.020.34±0.03150.19±0.03?0.45±0.040.42±0.040.27±0.02?0.42±0.04?300.21±0.04?0.39±0.05?0.54±0.06?0.35±0.03??0.53±0.06?600.27±0.04??0.32±0.04??0.84±0.08??0.41±0.03??0.63±0.06??900.28±0.06??0.28±0.05??0.98±0.10??0.40±0.04??0.67±0.08??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與對照組比較，白藜蘆醇(30、60、90 μmol/L)干預(yù)24 h后，細(xì)胞促凋亡因子Bax表達(dá)上升而抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)下降(P<0.05或P<0.01)，Bax/Bcl-2間的平衡被完全打破(P<0.01)；而白藜蘆醇濃度從15 μmol/L起，凋亡執(zhí)行因子Caspase-3、Caspase-9表達(dá)即較對照組顯著上升(P<0.05或P<0.01)，展現(xiàn)其良好的促前列腺癌細(xì)胞凋亡的效果(見表4)。

白藜蘆醇(μmol/L)BaxBcl-2Bax/Bcl-2Caspase-3Caspase-90(對照組)1.00±0.011.00±0.001.00±0.001.01±0.011.00±0.01151.24±0.210.86±0.091.44±0.151.47±0.20?1.55±0.14?301.87±0.27?0.72±0.09?2.60±0.25??2.02±0.22??1.98±0.23?60 2.24±0.34??0.54±0.07??4.13±0.47??2.51±0.33??2.27±0.37??90 2.32±0.36??0.53±0.06??4.32±0.44??2.58±0.04??2.41±0.35??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3　討論

前列腺癌是人類特有的疾病，具有發(fā)病率高、死亡率大的特點，其發(fā)病率排名全球癌癥第5位，男性死亡率則僅次于肺癌[6]。白藜蘆醇屬于多酚類化合物，具有抗腫瘤、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、保護(hù)心血管等生物學(xué)作用[7]。臨床研究表明，白藜蘆醇聯(lián)合化療藥物在治療肝癌、肺癌、乳腺癌等多種晚期惡性腫瘤患者時療效顯著，具有很好的臨床應(yīng)用前景[8]。本研究旨在探討白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的影響，為其在前列腺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境，由基因控制的自主有序的死亡，在細(xì)胞衰老、腫瘤的發(fā)生中起重要作用[9]。目前，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤研究的熱點，也是評價抗腫瘤藥物有效性的重要參考指標(biāo)。本研究顯示，白藜蘆醇能顯著抑制前列腺癌系PC-3細(xì)胞增殖，并能導(dǎo)致細(xì)胞的核碎裂、固縮、聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性，說明白藜蘆醇有良好的抑制前列腺癌細(xì)胞生長的作用。

Bcl-2家族是目前公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因，主要包括抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax等。Bcl-2主要是通過抗氧化或抑制氧自由基產(chǎn)生來阻止細(xì)胞凋亡，Bax則是能通過線粒體途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl-2間的平衡能決定細(xì)胞凋亡是否發(fā)生[10]。Bax、Bcl-2蛋白能在線粒體完整性的基礎(chǔ)上通過激活Caspase家族來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。Caspase家族相關(guān)蛋白的激活是誘發(fā)凋亡的直接效應(yīng)物，Caspase-3和Caspase-9則是Caspase家族中最關(guān)鍵的成員[12]。其中，Caspase-9起始于Caspase，主要參與細(xì)胞凋亡的啟動，而Caspase3則是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行者之一[13]。本研究檢測了白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白和mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能顯著上調(diào)促凋亡因子Bax而下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)，打破Bax/Bcl-2間的平衡；同時，上調(diào)凋亡執(zhí)行因子Caspase-3、Caspase-9蛋白和mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上，本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與破壞Bax/Bcl-2平衡，上調(diào)Caspase-3、Caspase-9表達(dá)有關(guān)。本研究闡明了白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的部分機(jī)制，為其治療該疾病的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，但其更多潛在的抗腫瘤活性及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。