FMOC-Cl柱前衍生高效液相色譜法測定L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽

解銀萍，王瀅秀，董文凱，柴洪偉

(山東省農(nóng)藥科學研究院 山東省化學農(nóng)藥重點實驗室，山東 濟南　250100)

L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽是有機合成中被廣泛應用的一種重要中間體[1]，是合成手型除草劑L-草銨膦的重要中間體[2]。L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽，英文名稱：L-homoserine lactone hydrochloride，CAS號：2185-03-7，分子式：C4H8ClNO2，中文名：L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽。結(jié)構(gòu)式：

目前，有關L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽含量的分析方法尚未見公開的報道。由于L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽幾乎沒有紫外吸收，本文運用FMOC-Cl柱前衍生化后用高效液相色譜法對L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽進行定量分析。FMOC-Cl以其反應產(chǎn)物穩(wěn)定、反應速度快和完全而成為十分理想的衍生試劑[3]，在本實驗中，多余的FMOC-Cl的水解產(chǎn)物不影響樣品的分離。實驗結(jié)果表明該方法具有操作簡便、快速、準確，分離效果好等特點，其精密度和準確度均能達到定量分析的要求。

1　試驗部分

1.1　試劑和溶液

乙腈：色譜純；硼酸：分析純；氫氧化鈉：分析純；水：二次蒸餾水；FMOC-Cl：99%(購于安耐吉化學)；L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣：97.0% (購于安耐吉化學)； L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽試樣：(本實驗室提供)。

5.00g/L的L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣標準儲備溶液的配制：準確稱取L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標準樣0.25 g(精確至0.0001)，置于50 mL容量瓶中，用水溶解，定容，搖勻備用。

0. 40 mol/ L 硼酸鹽緩沖溶液：將0.40mol/ L 硼酸溶液用6.0mol/ L的NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值到8.0。

1.0g/ L的FMOC-Cl衍生液：稱取0.05g FMOC-Cl溶解于50mL的乙腈中。

所有配制的溶液均保存于 4℃冰箱中。

1.2　儀器

高效液相色譜儀：島津LC-20AT，具有紫外檢測器；島津LC solution色譜工作站；色譜柱：WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。

1.3　液相色譜操作條件

流動相：V (乙腈)∶V (水)=50∶50；流量：1.0mL/min；檢測波長：210nm；柱溫：25℃；進樣體積：5μL；L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣的保留時間約13.43min。

如圖所示典型的L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣衍生樣和空白樣的高效液相色譜圖(圖1、圖2)。

圖1　L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣衍生樣色譜圖

圖2　L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽空白樣色譜圖

1.4　測定步驟

1.4.1樣品預處理

取L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽樣品溶液0.5mL于指形瓶中，加入1mL0.4mol/L的硼酸緩沖溶液，加入2mLFMOC-Cl衍生液，震蕩，暗處反應30min，待上機分析。

1.4.2測定步驟

待基線穩(wěn)定后，連續(xù)進入數(shù)針L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣衍生樣溶液，直至相鄰2針標樣衍生樣溶液的響應值相對變化<1.0%，而后按照標樣、試樣、試樣、標樣的順序進行測定。

1.4.3結(jié)果計算

將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣峰面積分別進行平均。試樣中L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽的質(zhì)量分數(shù)ω(%)，按式(1)計算：

(1)

(1)式中：

A1——標樣溶液中L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣峰面積的平均值；

A2——試樣溶液中L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣峰面積的平均值；

m1——標樣的質(zhì)量，g；

m2——試樣的質(zhì)量，g；

ω1——標樣中L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽的質(zhì)量分數(shù)，%。

2　測定結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的選擇

流動相的選擇：根據(jù)L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽的理化性質(zhì)，選擇常用的C18色譜柱，水作為樣品溶劑，乙腈和水溶液作為混合流動相?；旌喜煌壤牧鲃酉嘣谏V柱上進行試驗，最終確定流速為1.0mL/min，流動相為V (乙腈)∶V (水)=50∶50時，基線平穩(wěn)，樣品與雜質(zhì)能夠很好的分離，樣品色譜峰形對稱，如圖1、圖2所示。

檢測波長的選擇：利用島津高效液相色譜儀中的全波長掃描功能，得到L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣在190～370nm范圍內(nèi)的紫外波長掃描圖(圖3)。如圖所示L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣的最大吸收波長在207.43nm附近，故選用210 nm的檢測波長。

圖3　L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽衍生樣 190～370nm范圍內(nèi)的紫外吸收譜圖

2.2　分析方法線性相關性測定

將L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣標準儲備液依次稀釋為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的標準工作液，柱前衍生化處理后，取5μL進樣，每個標準溶液重復進樣2次，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，以待測物色譜圖的平均峰面積為縱坐標，繪制標準曲線(表1、圖4)。圖中橫坐標為標樣溶液的質(zhì)量濃度，縱坐標為平均峰面積，得到線性方程為y=8.2616×106x+947732， 其線性相關系數(shù)為0.9991。

表1　分析方法的線性相關性試驗結(jié)果

圖4L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽線性關系圖

2.3　方法精密度測定

在同一樣品中準確稱取5個0.02g(精確至0.0001)L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽試樣，用水溶解，定容至10mL。樣品預處理后在上述所選色譜操作條件下進行分析。分析結(jié)果表明該方法測得L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽的標準偏差為0.0016，變異系數(shù)為0.14%(表2)。

表2　分析方法的精密度試驗結(jié)果

2.4　方法準確度測定

準確稱取5個0.01g(精確至0.0001)的L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽試樣，再分別準確加入0.01g(精確至0.0001)的L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽標樣，用水溶解，定容至10mL。預處理后在上述選用的色譜操作條件下進行HPLC分析(表3)，分析結(jié)果表明該方法的測定L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽的平均回收率為99.39%。

表3　分析方法的準確度試驗結(jié)果

3　結(jié)論

本文建立了一種利用FMOC-Cl柱前衍生化的高效液相色譜法測定L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽的定量分析方法。它采用WondaSil C18色譜柱，1.0mL/min的流速，V (乙腈)∶V (水)=50∶50的流動相，25 ℃柱溫，210nm的波長進行檢測。實驗中還探討了該分析方法的線性相關性，精密度和準確性，結(jié)果顯示該方法的線性相關系數(shù)為0.9991，標準偏差為0.0016，平均回收率為99.39%。綜上所述，該分析方法針對L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽具有較高的準確度、精密度和良好的線性關系。它具有簡便、快速、準確的特點，被認為是一種切實可行的分析方法。