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    固相萃取—超高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮類藥物殘留

    2018-07-14 03:15:38李曉月仇玉潔李博恩楊品紅
    食品與機械 2018年5期
    關(guān)鍵詞:喹諾酮水產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液

    賀 江 李曉月 仇玉潔 李博恩 楊品紅

    (1. 湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 常德 415000;2. 環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖與加工湖南省重點實驗室,湖南 常德 415000;3. 湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 常德 415000)

    中國作為世界上著名的水產(chǎn)品養(yǎng)殖、生產(chǎn)和出口大國,水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界2/3,而漁藥殘留問題一直都是各方關(guān)注的焦點。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolone,F(xiàn)Qs)是一類十分重要的人工合成抗菌藥物,因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、組織穿透力強、價格低廉、與其它抗菌藥物無交叉耐藥性等特點[1],曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。但不合理的用藥可導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物及其代謝產(chǎn)物在水產(chǎn)品中的殘留,進(jìn)而引起食用者腸道菌群失衡或產(chǎn)生遠(yuǎn)期毒性作用及潛在“三致”(致癌、致畸、致突變)作用[2-3]。近年來,隨著社會對食品安全問題關(guān)注度逐漸增大,氟喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域的應(yīng)用開始受到限制,或制定了相應(yīng)的最大殘留限量(MRL)。歐盟和北美等國家早已在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用環(huán)丙沙星,中國也在NY 5070—2002《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》和NY 5071—2002《無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則》中將其列為禁用藥物。中國農(nóng)業(yè)部于2015年又發(fā)布了第2292號公告,禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種氟喹諾酮類藥物在食用動物中的使用。歐盟及中國規(guī)定水產(chǎn)品中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的最高殘留總限量為100 μg/kg。

    建立方便有效的殘留檢測方法,是加強水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留監(jiān)控的前提與基礎(chǔ)。目前,文獻(xiàn)報道中已有一系列的關(guān)于喹諾酮類藥物的檢測方法,如免疫分析法[4-5]、毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]等。其中HPLC方法相對來說最普遍,但其在靈敏度和檢測效率上仍存在不足。超高效液相色譜技術(shù)(UPLC)是一種較傳統(tǒng)HPLC方法更加靈敏和快速的分析方法,隨著該技術(shù)的發(fā)展和普及,極有望替代HPLC成為新一代食品安全檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。此外,在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中,樣品前處理的傳統(tǒng)方法多為液液萃取法,不僅復(fù)雜耗時而且精確度不高;而固相萃取(SPE)技術(shù)已在食品安全檢測中廣泛應(yīng)用。本研究旨在基于固相萃取(SPE)和超高效液相色譜(UPLC)技術(shù),建立可同時測定水產(chǎn)品中諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星6種氟喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法,為水產(chǎn)品的安全提供技術(shù)保障。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    草魚、鳊魚、鯽魚、黃骨魚:市售;

    氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液:美國A ChemTek公司;

    Cleanert PEP-2固相萃取柱:填料量200 mg,體積6 mL,博納艾杰爾公司;

    乙腈:色譜純,美國TEDIA公司;

    磷酸二氫鉀、檸檬酸、乙酸銨、磷酸等:均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    超高效液相色譜儀(配有FLR熒光檢測器): Acquity H-Class型,美國Waters公司;

    液相色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(1.76 μm,2.1 mm×50.0 mm),美國Water公司;

    高速冷凍離心機: Multifuge X1R型,賽默飛世爾科技中國有限公司;

    固相萃取裝置: DG-24型, 美國Supelco公司;

    電子分析天平: TX223L型, 日本島津公司;

    氮吹儀: HAD-24B型,北京恒奧德儀器儀表有限公司。

    1.3 方法與步驟

    1.3.1 6種氟喹諾酮類藥物UPLC分析條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    (1) UPLC分析條件的優(yōu)化:配置濃度均為500 ng/mL的6種氟喹諾酮藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,設(shè)定進(jìn)樣體積為0.2 μL,柱溫為50 ℃,檢測波長為λex=278 nm,λem=465 nm。參考有關(guān)文獻(xiàn)資料[11-14],重點對流動相的類型和流速進(jìn)行優(yōu)化,以獲取最佳檢測效果。

    (2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:按照表1用乙腈分別配制氟喹諾酮系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用已確定的UPLC分析檢測條件進(jìn)行檢測,并進(jìn)一步建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    表1 6種氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制Table 1 Preparation of mixed standard solution of six fluoroquinolones

    1.3.2 水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮藥物檢測前處理方案的建立

    (1) 固相萃取小柱的效果驗證:將2 mL濃度為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL作為模擬提取液過SPE小柱(用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化),再用3 mL 5%甲醇水淋洗,最后用6 mL甲醇洗脫。分別收集上樣過柱液、淋洗液、洗脫液,各取1 mL過0.22 μm濾膜上機檢測其中各種氟喹諾酮類藥物的含量,以驗證所用固相萃取柱的效果。

    (2) 提取方案的選擇:準(zhǔn)確稱取5 g經(jīng)攪碎的魚肉樣品(并做加標(biāo)處理),分別加入10 mL酸化乙腈(2%甲酸)、鹽酸(1 mol/L)、四丁基溴化銨(3 mol/L)和磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH 4.5)4種不同溶劑,渦旋混勻1 min后超聲波(40 kHz, 50 W)提取10 min,再于10 000 r/min離心10 min 取上清液,重復(fù)提取3次。合并提取液,按上述SPE操作進(jìn)行凈化,洗脫液經(jīng)氮吹濃縮至干后,殘渣用0.2%的甲酸水溶液溶解后過0.22 μm濾膜供UPLC分析。

    1.3.3 方法評價

    (1) 添加回收試驗和重復(fù)性試驗:按照表2所示A、B、C 3組不同的添加水平,在空白基質(zhì)魚肉中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個添加水平重復(fù)3次,同時做空白試驗。按照所優(yōu)化的方案進(jìn)行前處理,再用所建立的UPLC方法檢測氟喹諾酮藥物的含量。用添加回收率評價方法的準(zhǔn)確度,用多次檢測的添加回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評價方法的精密度。

    (2) 最低檢出限和最低定量限試驗:參照美國EPA標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的單濃度重復(fù)試驗方法進(jìn)行最低檢出限和最低定量限的測定[15]。

    1.3.4 市售水產(chǎn)樣品中6種氟喹諾酮藥物的檢測 按照1.3.1 和1.3.2所優(yōu)化的色譜方法和前處理方法,分別對某超市采購的草魚、鳊魚、鯽魚、黃骨魚進(jìn)行氟喹諾酮類藥物檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 6種氟喹諾酮類藥物UPLC分析條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

    氟喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)上有羧基和哌嗪基,具有酸堿兩性,又由于分子結(jié)構(gòu)相似,給液相色譜分離帶來一定的難度。根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]報道,為防止色譜峰拖尾,通常選用酸性溶液如檸檬酸、乙酸銨、乙腈、甲醇、三乙胺等多種配比作為流動相。在本試驗條件下,嘗試采用多種流動相配比和流速。最終結(jié)果表明:以體積比為93∶7的0.05 mol/L 檸檬酸+0.1 mol/L 乙酸銨緩沖液-乙腈為流動相,流速為0.42 mL/min 時,在Waters Acquity UPLC?BEH C18柱(1.7 μm, 2.1 mm×50.0 mm)上10 min內(nèi)將6種氟喹諾酮類藥物有效分開(圖1),與傳統(tǒng)的HPLC方法相比,檢測效率明顯提高。以此色譜條件,分析1.3.1中氟喹諾酮系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到6種氟喹諾酮藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、決定系數(shù)R2和線性范圍見表3。

    2.2 水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮藥物檢測前處理方案的建立

    2.2.1 固相萃取小柱的效果驗證 固相萃取柱應(yīng)用效果的影響因素除填料類型外,也包括填料的粒徑以及填料裝填的緊密程度等,因此不同品牌的同一類型固相萃取柱也可能會產(chǎn)生不同的效果。本研究用標(biāo)準(zhǔn)溶液作為模擬樣品,對所選用的Cleanert PEP-2固相萃取小柱進(jìn)行了有效性驗證。結(jié)果表明,上樣過柱液、淋洗液中均未檢出6種氟喹諾酮,而洗脫液中6種氟喹諾酮類藥物的含量與預(yù)期基本相符,回收率為95.9%~100.7%(表4),說明選用的固相萃取柱有效。

    表2 添加回收試驗中6種氟奎諾酮類藥物的 添加水平設(shè)置Table 2 Spiking levels of six fluoroquinolones in recovery test μg/kg

    諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星濃度為160 ng/mL;培氟沙星濃度為40 ng/mL;恩諾沙星濃度為80 ng/mL

    圖1 6種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Figure 1 UPLC chromatogram of six kinds of fluoroquinolones standard表3 6種氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍Table 3 Standard curve equation and linear range of six kinds of fluoroquinolones

    表4固相萃取過程中各部分收集液中6種氟喹諾酮類藥物的含量及回收率?

    Table 4 Concentration and recovery of six kinds of fluoroquinolones in different part of solution during SPE process (n=3)

    藥物名稱含量/(ng·mL-1)上樣過柱液a淋洗液洗脫液b回收率/%諾氟沙星未檢出未檢出166.77100.1氧氟沙星未檢出未檢出159.9095.9環(huán)丙沙星未檢出未檢出164.5698.7培氟沙星未檢出未檢出162.2297.3洛美沙星未檢出未檢出167.88100.7恩諾沙星未檢出未檢出161.1496.7

    ? a. 將2 mL濃度均為500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL作為模擬樣品進(jìn)行上樣; b. 洗脫液體積為6 mL。

    2.2.2 提取方案的選擇 樣品前處理過程中不同的提取劑的提取能力有很大差異,目前常用的提取劑主要有酸性乙腈[16]、磷酸鹽緩沖液[17]、鹽酸[18]、二氯甲烷[19]等水溶液或有機溶劑。為了最大效率提取樣品中6種氟喹諾酮類藥物,本研究比較了酸化乙腈(2%甲酸)、鹽酸(1 mol/L)、四丁基溴化銨(3 mol/L)和磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH=4.5) 4種提取溶劑的提取效果,結(jié)果見表5。使用酸化乙腈提取時,樣品蛋白質(zhì)極易快速沉淀,造成待測物包裹損失,提取效果不佳;使用1 mol/L的鹽酸溶液提取時,提取液中脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較高,后續(xù)凈化過程中易堵塞固相萃取柱;而四丁基溴化銨和磷酸鹽緩沖液提取時效果較好。綜合考慮,選用磷酸鹽緩沖溶液(pH 4.5)作為最終的提取溶劑。

    2.3 方法評價

    在確定UPLC分析條件和水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮藥物提取、凈化等前處理方案的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對整套檢測方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度進(jìn)行了評價,結(jié)果見表6。由表6可知,6種氟喹諾酮藥物的添加回收率為63.69%~90.83%,最低檢出限為0.5~1.8 μg/kg,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%,表明方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量管理規(guī)范食品理化檢測》的相關(guān)要求。

    2.4 市售魚樣品中6種氟喹諾酮藥物的檢測

    按照1.3.1和1.3.2所優(yōu)化的色譜方法和前處理方法,對常德市區(qū)某超市出售的草魚、鳊魚、鯽魚、黃古魚4種水產(chǎn)品進(jìn)行了6種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測,相關(guān)色譜圖見圖2。結(jié)果表明:諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星5種禁用藥物在4種水產(chǎn)品中均未檢出;恩諾沙星在草魚、鳊魚、鯽魚中有檢出,黃古魚中未檢出,其中草魚中的殘留量低于檢測方法的最低定量限,鳊魚和鯽魚的殘留量分別為5.158,7.083 μg/kg,也均低于恩諾沙星在水產(chǎn)品肌肉中的最大殘留限量(100 μg/kg)。

    表5 不同提取劑提取效果的比較Table 5 Comparison of extraction effects of different extractants

    表6 水產(chǎn)品6種氟喹諾酮類藥物檢測分析方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度評價結(jié)果Table 6 The accuracy, precision, and sensitivity of the analysis methods for 6 kind of fluoroquinolones in aquatic products (n=3)

    圖2 4種魚中氟喹諾酮類藥物殘留檢測色譜圖Figure 2 UPLC chromatogram of fluoroquinolones determination in grass carpa

    3 結(jié)論

    本研究基于固相萃取(SPE)和超高效液相色譜(UPLC)建立了水產(chǎn)品中的6種氟喹諾酮藥物殘留的檢測方法,并利用該方法對4種常見的市售水產(chǎn)品進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,該方法的前處理過程簡單有效,上機分析過程較傳統(tǒng)的HPLC分析耗時明顯縮短(10 min即可完成分析);靈敏度明顯提高(最低檢出限為0.5~1.8 μg/kg);準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性符合檢測要求,添加回收率為63.69%~90.83%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%。綜合說明,該方法有望為氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)分析方法的建立提供借鑒和參考。

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