酶解對(duì)白果濁汁穩(wěn)定性及色澤的影響

倪 洋 范柳萍 徐學(xué)碗

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江蘇港城中藥養(yǎng)生有限公司，江蘇 泰州 225321 )

白果濁汁飲料屬于一種淀粉質(zhì)植物蛋白飲料，由于淀粉糊化后易老化，飲料在生產(chǎn)過(guò)程中和貨架存放期內(nèi)易出現(xiàn)析水分層、膠凝結(jié)塊和沉淀的現(xiàn)象。目前，工業(yè)上常用的方法是利用淀粉酶和糖化酶對(duì)原料里的淀粉進(jìn)行酶解處理[1]24。利用淀粉酶酶解植物原料中的淀粉制備植物蛋白飲料已經(jīng)有很多研究，比如史銀銀[2]利用中溫α-淀粉酶、中性蛋白酶和糖化酶酶解白果淀粉制備白果飲料；楊婧曦[3]使用α-淀粉酶、果膠酶、β-淀粉酶和糖化酶酶解白果中淀粉研制白果飲料；Zhang等[4]利用響應(yīng)面優(yōu)化α-淀粉酶和蛋白酶的酶解條件制備白果濁汁；賈可華[5]18-19應(yīng)用淀粉酶酶解大麥淀粉制備乳濁液；姜紹通[6]28以板栗為原料采用淀粉酶酶解板栗淀粉制備板栗飲料，潘麗軍等[7]用中溫α-淀粉酶、葡萄糖糖化酶酶解原料紫薯，與蘋果汁進(jìn)行復(fù)配制得紫薯復(fù)合飲料等等。這些研究很多只是把淀粉酶酶解淀粉作為一種手段，通過(guò)優(yōu)化酶解條件以充分酶解淀粉，然后過(guò)濾或者離心得到酶解液，研究對(duì)象主要集中在復(fù)配穩(wěn)定劑對(duì)于植物蛋白飲料穩(wěn)定性方面，但是忽略了由于淀粉酶解導(dǎo)致體系物理性質(zhì)改變，并且過(guò)濾和離心工序會(huì)損失很多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)淀粉被充分酶解后，飲料中的還原糖含量比較高，由于植物蛋白飲料屬于中性飲料，滅菌條件為121 ℃，20 min。含有豐富還原糖和蛋白質(zhì)的體系在高溫和長(zhǎng)期貯存的條件下容易發(fā)生美拉德反應(yīng)[8]。在高強(qiáng)度的滅菌條件下，淀粉高度酶解的飲料其顏色變化會(huì)很大，影響感官。淀粉被酶解后飲料體系中像黏度、Zeta電位等物理性質(zhì)也會(huì)發(fā)生很大改變，這些物理性質(zhì)與飲料體系的穩(wěn)定性有很大的關(guān)聯(lián)性。

目前，白果濁汁飲料穩(wěn)定性的研究主要集中在復(fù)配穩(wěn)定劑方面，很少單獨(dú)研究淀粉的酶解程度對(duì)飲料體系穩(wěn)定性的影響。本試驗(yàn)通過(guò)酶解工序制備淀粉不同酶解程度的白果濁汁，分析不同酶解程度白果濁汁的穩(wěn)定性，并結(jié)合酶解后黏度、電位和粒徑等物理性質(zhì)的變化闡明白果濁汁中淀粉酶解與體系穩(wěn)定性的關(guān)系，以期為白果飲料的工業(yè)生產(chǎn)提供酶解條件和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白果：大佛指，購(gòu)于江蘇泰州；

中溫α-淀粉酶：酶活2 000 U/mL，無(wú)錫杰能科酶試劑有限公司；

糖化酶：酶活1 200 U/g，東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

均質(zhì)機(jī)：AH-2010型，安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2600型，日本島津公司；

流變儀：DHR-3型，美國(guó)沃特世公司；

激光粒度分析儀：S3500型，美國(guó)Microtrac公司；

多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀：Nano Brook Omni型，美國(guó)布魯克海文儀器公司;

高精度分光測(cè)色儀：UltraScan Pro1166型，美國(guó)Hunterlab公司。

1.3 方法

1.3.1 白果濁汁制備工藝 根據(jù)Zhang等[4]的濁汁制備工藝修改為：

原料白果→挑選→清洗→去殼、去內(nèi)種皮→預(yù)煮糊化→膠體磨→過(guò)200目篩→酶解→均質(zhì)→殺菌→白果濁汁

預(yù)煮糊化：白果放入0.2% Na2CO3的沸水中加熱20 min，將白果中的淀粉充分糊化，同時(shí)熱處理還可以去除氰化物以及部分銀杏酚酸。

膠體磨：按照料液比1∶10 (g/mL)的比例，用膠體磨研磨5 min。

酶解：中溫α-淀粉酶和糖化酶共同作用。

均質(zhì)：均質(zhì)壓力為40 MPa，均質(zhì)2次。

滅菌：滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.3.2 酶解的正交優(yōu)化 在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇中溫α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量和酶解溫度作為試驗(yàn)因素，固定料液比1∶10 (g/mL)、酶解時(shí)間60 min，以DE值作為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的正交優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.3.3 不同酶解程度白果濁汁的制備 取5份相同體積的白果漿液，在優(yōu)化后的酶解條件下，分別進(jìn)行10，30，60，90，120 min的酶解，酶解結(jié)束后立即滅酶滅菌，得到淀粉不同酶解程度的白果濁汁。

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法[6]12。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels of orthogonal experiment

1.3.5 總固形物含量的測(cè)定 吸取5 mL樣品，在105 ℃下烘干至恒重[5]20，稱重，計(jì)算總固形物含量。

1.3.6 DE值的計(jì)算 DE值為葡萄糖當(dāng)量，是還原糖占糖漿干物質(zhì)的比重[9]，按式(1)計(jì)算DE值。

(1)

式中：

c——DE值，%；

m1——還原糖含量，mg/mL；

m2——總固形物含量，mg/mL。

1.3.7 懸浮穩(wěn)定性的測(cè)定 根據(jù)Sims等[10]的方法修改如下：取10 mL 飲料，于3 000 r/min離心10 min，取上清液用去離子水稀釋100倍，以去離子水作為參照，于660 nm處測(cè)定離心前后的吸光值。按式(2)計(jì)算懸浮穩(wěn)定性。

(2)

式中：

c——懸浮穩(wěn)定性，%；

A1——濁汁離心后的吸光度；

A2——濁汁離心前的吸光度。

1.3.8 流變性質(zhì)的測(cè)定 利用流變儀進(jìn)行測(cè)定。取適量白果濁汁樣品加入流變儀平板上，間距設(shè)為0.100 mm，剪切速率為0～100 s-1，用40 mm的2°錐板模具于(25.0±0.1) ℃下測(cè)量白果濁汁流變性質(zhì)[11]。

1.3.9 粒徑的測(cè)定 用激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定。在室溫下吸取一定量的白果濁汁至去離子水中測(cè)定白果濁汁的粒徑，記錄平均粒徑D50、體積平均粒徑D[4,3]和面積平均粒徑D[3,2][1]36[12]。

1.3.10 Zeta電位的測(cè)定 根據(jù)趙光遠(yuǎn)等[13]的方法修改如下：將樣品用去離子水稀釋100倍，震蕩混勻后放入電極中利用Zeta電位儀測(cè)量電位。

1.3.11 貯藏試驗(yàn) 將滅菌后的白果濁汁放置于4 ℃冰箱中，讓淀粉加速老化，2 d后觀察濁汁穩(wěn)定性。

1.3.12 色差的測(cè)定 以未酶解的白果濁汁作為對(duì)照，利用高精度激光測(cè)色儀測(cè)量不同酶解時(shí)間白果濁汁滅菌前后的L、a、b值，按式(3)計(jì)算△E。L值表示亮度，a值代表紅綠偏向，b值代表有色物質(zhì)的黃藍(lán)偏導(dǎo)率；△E為色差，計(jì)算公式見(jiàn)式(3)?！鱁數(shù)值越高則表明試驗(yàn)原料的顏色變化越大[10，14]。

(3)

式中：

△E——色差；

△L——L樣-L標(biāo)；

△a——a樣-a標(biāo)；

△b——b樣-b標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 酶解工藝的優(yōu)化

白果中含有66%的淀粉(干基)[2]31，淀粉的酶解對(duì)濁汁飲料的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。淀粉處于糊化狀態(tài)，有利于淀粉酶的酶解，因此充分糊化白果中的淀粉很有必要，20 min 的蒸煮可以使得淀粉充分糊化。同時(shí)由于白果中含有一定的有毒物質(zhì)(主要為氰化物和銀杏酚酸)，通過(guò)Na2CO3浸泡結(jié)合加熱處理可以有效去除氰化物和部分銀杏酚酸，白果濁汁飲料中的銀杏酚酸含量小于2015版《中國(guó)藥典》限定的10 mg/kg。

由表2可以看出，3個(gè)因素對(duì)酶解效率影響的順序?yàn)椋好附鉁囟?α-淀粉酶添加量>糖化酶添加量，其中酶解溫度為65 ℃的試驗(yàn)組比60，70 ℃的效率高，α-淀粉酶添加量越多酶解效率越高。表3表明，α-淀粉酶添加量和酶解溫度對(duì)酶解效率有顯著影響，而糖化酶添加量對(duì)酶解效率沒(méi)有顯著影響。所以綜合極差及方差分析結(jié)果最優(yōu)方案為：A3B3C2，即α-淀粉酶添加35 U/g·果肉，糖化酶添加60 U/g·果肉，酶解溫度為65 ℃。在此條件下，酶解的效率最高，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)DE值為(55.63±0.56)%。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)白果濁汁穩(wěn)定性的影響

不同酶解程度白果濁汁的穩(wěn)定性情況見(jiàn)表4和圖1。

由表4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，DE值和可溶性固形物持續(xù)增長(zhǎng)，而懸浮穩(wěn)定性是先增加后穩(wěn)定再下降。由于淀粉酶和糖化酶對(duì)濁汁中的淀粉持續(xù)酶解，大分子的淀粉被酶解成還原糖和糊精，使得DE值以及可溶性固形物的含量增加，酶解120 min后DE值可以達(dá)到70%以上。懸浮穩(wěn)定性值越大代表飲料越穩(wěn)定[2]28，因此從懸浮穩(wěn)定性數(shù)據(jù)可知，濁汁穩(wěn)定性在酶解前30 min不斷升高，隨后在30～60 min時(shí)較穩(wěn)定，60 min后開(kāi)始下降，圖1也可以看見(jiàn)相似的現(xiàn)象，說(shuō)明一定時(shí)間內(nèi)酶解淀粉有助于提高濁汁的穩(wěn)定性，但是酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)降低濁汁的穩(wěn)定性。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment design and results

表3 方差分析結(jié)果?Table 3 Results of variance analysis

? *表示F檢驗(yàn)有顯著差異；**表示F檢驗(yàn)有極顯著差異，F(xiàn)0.05(2,2)=19.0；F0.01(2,2)=99.0。

表4不同酶解時(shí)間下白果濁汁DE值、可溶性固形物

和懸浮穩(wěn)定性?

Table 4 DE value, soluble solid and suspension stability of ginkgo cloudy juice under different enzymatic hydrolysis time(n=3)

酶解時(shí)間/minDE值/%可溶性固形物/Brix懸浮穩(wěn)定性/%1020.21±1.16a5.52±0.12a22.18±1.20c3040.59±0.68b6.10±0.09b25.36±0.62d6055.47±1.37c6.45±0.15c24.52±0.94d9065.82±0.83d6.62±0.11cd21.51±1.32b12073.34±1.26e6.80±0.10d18.38±0.53a

? 同列不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

將白果濁汁放置在4 ℃環(huán)境下，使得體系加速不穩(wěn)定。由于是濁汁飲料，含有豐富的淀粉、蛋白和纖維等大顆粒物質(zhì)。它們有些不溶于水，是以懸浮的狀態(tài)存在于濁汁體系中，懸浮在飲料中的物質(zhì)越多，說(shuō)明濁汁的體系越穩(wěn)定。從圖1可以看出，不同酶解時(shí)間(即不同酶解程度)的白果濁汁具有不一樣高度的上清液和懸浮物。隨著酶解的進(jìn)行懸浮物高度先升高，然后不變，60 min后懸浮物高度下降。尤其酶解120 min的白果濁汁，懸浮物大部分已經(jīng)沉入瓶底，濁汁此時(shí)很不穩(wěn)定。說(shuō)明酶解30～60 min(DE值為40%～55%)的白果濁汁有較好的穩(wěn)定性。

圖1 于4 ℃放置2 d后不同酶解時(shí)間白果濁汁 的懸浮物高度Figure 1 The height of suspended particles of ginkgo juice after 2 days in the 4 ℃ stored

2.3 酶解時(shí)間對(duì)白果濁汁黏度的影響

由圖2可知，隨著剪切速率的增加，不同酶解時(shí)間下白果濁汁的表觀黏度均逐漸減小，白果濁汁表現(xiàn)出剪切變稀的假塑性流體特征[15]。酶解10 min的濁汁對(duì)比未酶解的濁汁，其黏度迅速下降，當(dāng)酶解時(shí)間進(jìn)一步增加，白果濁汁的黏度緩慢下降，最后趨于不變?？赡苁前坠麧嶂械矸鄣孺湢畲蠓肿游镔|(zhì)在水溶液中相互纏繞、連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加了分子間的作用力，會(huì)使得濁汁的黏度比較大[1]33-34。當(dāng)?shù)矸勖负吞腔讣尤霛嶂?，體系中大分子鏈狀的淀粉可能迅速被切斷，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)難以維持，濁汁的黏度也迅速下降，當(dāng)酶解繼續(xù)進(jìn)行，淀粉含量降低，濁汁黏度也會(huì)進(jìn)一步降低，最后隨著淀粉的完全酶解，濁汁黏度變的很小。

圖2 不同酶解時(shí)間下白果濁汁的黏度Figure 2 The viscosity of ginkgo cloudy juice under different hydrolysis time

濁汁經(jīng)過(guò)酶解后其流變性質(zhì)發(fā)生很大改變，表觀黏度的變化是最宏觀的體現(xiàn)[16]。由于黏度的降低會(huì)使得一些不溶大顆粒物質(zhì)在重力作用下沉入瓶底，如圖1中酶解120 min 的白果濁汁其大部分的懸浮物質(zhì)都已經(jīng)沉入瓶底。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)白果濁汁Zeta電位的影響

由圖3可知，白果濁汁Zeta電位的絕對(duì)值隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先迅速升高然后又緩慢降低。當(dāng)Zeta電位的絕對(duì)值>30 mV，說(shuō)明體系比較穩(wěn)定，顆粒間的靜電排斥力比較大，顆粒不容易吸附[17]。酶解30，60 min 時(shí)白果濁汁Zeta電位的絕對(duì)值都大于30 mV，說(shuō)明此時(shí)白果濁汁中微粒間有較大的排斥力，不容易相互吸附。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)60 min，濁汁體系Zeta電位的絕對(duì)值又緩慢下降。原因可能是在酶解剛開(kāi)始的時(shí)候，濁汁體系中的鏈狀淀粉高分子被切斷，被淀粉分子包裹的果膠、蛋白等一些帶電物質(zhì)暴露在體系中，使得Zeta電位迅速下降[18]。隨著酶解的進(jìn)一步進(jìn)行，大量的淀粉被酶解，體系黏度進(jìn)一步降低，使得其他顆粒之間更容易接觸吸附，從而導(dǎo)致Zeta電位又緩慢上升。

圖3 不同酶解時(shí)間下白果濁汁的Zeta電位Figure 3 Zeta potential of ginkgo cloudy juice under different hydrolysis time

不同酶解時(shí)間的白果濁汁表現(xiàn)出不同的Zeta電位，酶解時(shí)間長(zhǎng)的白果濁汁Zeta電位的絕對(duì)值相對(duì)較小，同時(shí)體系黏度很低，使得白果濁汁中一些蛋白、果膠等帶電的顆粒更容易吸附在一起，從而進(jìn)一步引起濁汁體系的不穩(wěn)定。因此，并非酶解時(shí)間越長(zhǎng)越好。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)白果濁汁粒徑的影響

D[4,3]可以反映白果濁汁體系中大顆粒的變化，D[3,2]可以反映白果濁汁中小顆粒的變化，D50表示的是中位粒徑[1]36。由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，D[4,3]的增長(zhǎng)趨勢(shì)比D[3,2]大的多，同時(shí)D50的變化趨勢(shì)和D[4,3]的相似，說(shuō)明白果濁汁粒徑變化的主要原因來(lái)源于大顆粒物質(zhì)的增加?？赡苡捎诿附夂篌w系的黏度很快降低，同時(shí)當(dāng)酶解30 min以后，Zeta電位絕對(duì)值隨著酶解的增加而降低，使得體系中蛋白和果膠等大分子物質(zhì)更容易吸附在一起，導(dǎo)致體系粒徑的增大。

結(jié)合表4可知，濁汁體系中的可溶性固形物隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，說(shuō)明淀粉被酶解成糊精和一些小分子糖類溶入濁汁中。由試驗(yàn)結(jié)果可知，濁汁體系的粒徑隨著酶解的進(jìn)行反而增加，這并不利于濁汁飲料的穩(wěn)定性，但另一方面如果白果濁汁中淀粉不進(jìn)行酶解，經(jīng)過(guò)加熱糊化后，淀粉會(huì)很快老化，濁汁口感粗糙，放置一段時(shí)間就會(huì)整體出現(xiàn)分層現(xiàn)象，因此淀粉的酶解是有必要的。但隨著淀粉被酶解，濁汁體系中的黏度、粒徑、Zeta電位都會(huì)變化，它們之間會(huì)相互影響，相互作用，并且由圖1可知并不是酶解時(shí)間越長(zhǎng)飲料就越穩(wěn)定。

圖4 不同酶解時(shí)間下白果濁汁的粒徑Figure 4 Particle size of ginkgo cloudy juice under different hydrolysis time

2.6 酶解及滅菌對(duì)白果濁汁色澤的影響

由圖5可知，滅菌前濁汁的△E值隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，說(shuō)明酶解時(shí)間對(duì)濁汁色澤有一定的影響。相同酶解時(shí)間下濁汁滅菌前后的△E值變化很大，說(shuō)明滅菌工藝顯著影響濁汁的色澤?！鱁值是指總色差的大小，當(dāng)△E值在3以下認(rèn)為色差在可接受范圍，與對(duì)照樣品的顏色相差比較小；當(dāng)△E值大于3，視覺(jué)上可以分辨出顏色的差別[14]。酶解60 min以上的白果濁汁滅菌后的△E值都顯著大于3，說(shuō)明此時(shí)白果濁汁的色澤變化可以被肉眼所觀察，呈現(xiàn)一種暗黃色。含有豐富的淀粉、還原糖以及蛋白質(zhì)的體系在高溫和長(zhǎng)期貯儲(chǔ)時(shí)容易發(fā)生美拉德反應(yīng)[8]。白果濁汁經(jīng)過(guò)淀粉酶酶解后產(chǎn)生大量的還原糖，在121 ℃的滅菌高溫下與蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)很容易發(fā)生美拉德反應(yīng)，使得顏色變暗，酶解時(shí)間越長(zhǎng)還原糖的含量越多，濁汁的顏色變化越深。因此，濁汁中淀粉的酶解程度對(duì)濁汁色澤也有很大的影響。

圖5 不同酶解時(shí)間白果濁汁滅菌前后的色差變化Figure 5 The change of color of ginkgo cloudy juice under different hydrolysis time

3 結(jié)論

白果濁汁經(jīng)過(guò)酶解處理以后，整個(gè)體系的黏度、電位、粒徑等物理性質(zhì)均會(huì)發(fā)生顯著變化，這些變化會(huì)直接影響白果濁汁的穩(wěn)定性。研究表明當(dāng)酶解DE值為40%～55%時(shí)，白果濁汁具有較好的穩(wěn)定性。同時(shí)，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響濁汁色差。本研究為白果渾濁型飲料的加工生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

雖然酶解工藝可以影響白果濁汁的穩(wěn)定性，但是僅僅依靠酶解并不能長(zhǎng)期穩(wěn)定白果濁汁飲料。因此為保證白果濁汁飲料的長(zhǎng)期穩(wěn)定，還需要進(jìn)一步研究酶解和穩(wěn)定劑、均質(zhì)等工藝的結(jié)合，尋找出更高效、更經(jīng)濟(jì)、更穩(wěn)定的工藝方法。