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    動(dòng)態(tài)高壓微射流協(xié)同美拉德反應(yīng)對(duì)α-乳白蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

    2018-07-14 03:08:00涂宗財(cái)邵艷紅謝雅雯沙小梅
    食品與機(jī)械 2018年5期
    關(guān)鍵詞:拉德乳糖接枝

    楊 萍 涂宗財(cái),3 劉 俊 邵艷紅 謝雅雯 沙小梅 張 露

    (1. 江西師范大學(xué)功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330022;2. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330022;3. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

    α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-LA)屬于溶菌酶家族,結(jié)構(gòu)呈球形,其單體由123個(gè)氨基酸組成,分子量約為14.2 kDa。α-LA是乳清蛋白中唯一能結(jié)合鈣離子的蛋白,且4個(gè)天冬氨酸殘基均能結(jié)合鈣離子,其獨(dú)特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)賦予α-LA突出的功能特性和生物學(xué)活性,使其在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)廣泛應(yīng)用[1]。在臨床領(lǐng)域,α-LA 具有抗氧化、降血壓、抗癌、降血脂、抗病毒、抗菌、螯合金屬等作用[2]。

    目前,許多改性方法如輻照[3]、美拉德[4]、熱處理[5]等,用于提高α-LA的功能性質(zhì)。而動(dòng)態(tài)高壓微射流(Dynamic high pressure microfluidization,DHPM)是一種集高速碰撞、高頻振蕩、瞬時(shí)壓力降、強(qiáng)剪切、氣穴作用和超高壓作用為一體的新興高壓加工技術(shù),被廣泛用于生物大分子的改性[6]。研究發(fā)現(xiàn)DHPM預(yù)處理能誘導(dǎo)牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng),提高BSA的美拉德反應(yīng)程度[7]。此外美拉德反應(yīng)是一種蛋白質(zhì)的游離氨基和還原糖的羧基之間的化學(xué)反應(yīng),能改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì),如卵清蛋白經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后,其乳化性、起泡性得到顯著改善[8]。然而,對(duì)DHPM結(jié)合美拉德反應(yīng)改性α-LA的研究較少。

    本研究擬以α-LA為研究對(duì)象,采用DHPM結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA進(jìn)行復(fù)合改性,研究改性后的結(jié)構(gòu)、乳化特性和抗氧化活性,為拓寬α-LA在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    牛乳α-LA:L-6010,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;

    乳糖、鄰苯二甲醛(OPA)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇:分析純,索萊寶試劑有限公司;

    大豆油:市售;

    碘化鉀、甲醇:分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;

    硼砂:分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);

    乳糖:分析純,阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.1.2 主要儀器設(shè)備

    紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):U-3200型,日本日立公司;

    熒光分光光度計(jì):F-7000型,日本日立公司;

    納米超高壓均質(zhì)機(jī):NCJJ-0.007/200型,廊坊通用機(jī)械有限公司;

    圓二色譜儀:MOS 450型,法國(guó)Bio-Logic公司;

    冷凍干燥機(jī):LGJ-1D-80型,北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;

    旋渦混合儀:WH-866型,上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司;

    酶標(biāo)儀:SynergyH1型,美國(guó)Bio Tek公司。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品制備 稱(chēng)取一定質(zhì)量的α-LA,溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS),配制成濃度為1 mg/mL的溶液。經(jīng)微射流均質(zhì)機(jī)處理,均質(zhì)壓力分別為0,80,110,140 MPa,常溫下處理3次,收集溶液,取其中一部分溶液加入等質(zhì)量的乳糖,混勻,分裝凍干,分別記為L(zhǎng)A-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac、LA-140-Lac,余下溶液不加糖,分別記N-LA、LA-80、LA-110、LA-140,分裝凍干冷藏備用。將凍干后的樣品置于培養(yǎng)箱中,在55 ℃,相對(duì)濕度65%的條件下反應(yīng)8 h,反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于冰浴中終止反應(yīng)。4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 SDS-PAGE 根據(jù)文獻(xiàn)[9]。

    1.2.3 接枝度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]。用相同的方法,以賴(lài)氨酸代替樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),以吸光度為縱坐標(biāo)(y),游離氨基含量為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=1.287x+0.007。

    1.2.4 內(nèi)源熒光性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11]。

    1.2.5 表面疏水性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[12]。

    1.2.6 圓二色譜分析 根據(jù)文獻(xiàn)[11]。

    1.2.7 乳化性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[13]。

    1.2.8 ABTS+·清除能力 根據(jù)文獻(xiàn)[14]。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    本試驗(yàn)均重復(fù)3次,所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),Origin 8.6軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SDS-PAGE

    圖1為DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德改性對(duì)α-LA分子量的影響。由圖1可知,α-LA的分子量在14.4 kDa左右,與N-LA相比,LA-80、LA-110和LA-140的電泳條帶均無(wú)明顯變化。α-LA與乳糖混合樣品的條帶均上移,說(shuō)明α-LA與乳糖發(fā)生了共價(jià)結(jié)合,分子量增加;然而,LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac條帶之間沒(méi)有顯著差別。此外所有的樣品在31 kDa附近出現(xiàn)明顯條帶,這是因?yàn)棣?LA 在美拉德反應(yīng)過(guò)程中分子之間發(fā)生了聚合,形成了二聚體[15]。

    M. Marker蛋白 1. N-LA 2. LA-80 3. LA-110 4. LA-1405. LA-0-Lac 6. LA-80-Lac 7. LA-110-Lac 8. LA-140-Lac圖1 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德改性前后α-LA的 SDS-PAGE電泳圖

    Figure 1 SDS-PAGE ofα-LA treated by DHPM pretreatment combined with Maillard reaction

    2.2 接枝度的測(cè)定

    游離氨基含量能夠用來(lái)評(píng)價(jià)美拉德反應(yīng)的程度[16],并以接枝度的形式表示。如圖2所示,LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的接枝度均大于LA-0-Lac,且隨著處理壓力的增大,樣品的接枝度顯著增加(P<0.05)。表明DHPM預(yù)處理能夠促進(jìn)美拉德反應(yīng),原因是高壓作用改變了α-LA的空間構(gòu)象,暴露出更多的反應(yīng)位點(diǎn),提高了美拉德反應(yīng)程度[7]。當(dāng)壓力達(dá)到110 MPa時(shí),LA-110-Lac的接枝度達(dá)到最大,說(shuō)明美拉德反應(yīng)程度達(dá)到最大。但當(dāng)處理壓力大于110 MPa 時(shí),LA-140-Lac的接枝度顯著降低(P<0.05),可能是過(guò)大的壓力作用使α-LA空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,且美拉德反應(yīng)促進(jìn)了蛋白質(zhì)的聚合反應(yīng),掩蓋了部分反應(yīng)基團(tuán)[17],降低其接枝度。

    不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖2 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA接枝度的影響

    Figure 2 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the degree of grafting ofα-LA

    2.3 內(nèi)源性熒光測(cè)定

    內(nèi)源性熒光是檢測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)常用的方法。圖3為不同處理壓力結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA內(nèi)源性熒光的影響。經(jīng)DHPM處理后,α-LA的熒光強(qiáng)度先升高后降低。這是因?yàn)镈HPM的高速碰撞、高頻振蕩、強(qiáng)剪切、氣穴作用等,破壞了α-LA的空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致隱藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的Trp更多地暴露在極性環(huán)境中,從而增加α-LA熒光強(qiáng)度。當(dāng)壓力超過(guò)110 MPa,LA-140熒光強(qiáng)度降低,與Maresca等[18]的研究結(jié)果類(lèi)似。經(jīng)乳糖美拉德反應(yīng)后,LA-Lac體系的熒光強(qiáng)度顯著降低,可能是因?yàn)棣?LA與乳糖的結(jié)合對(duì)部分色氨酸起到了屏蔽作用。且隨處理壓力的增大,熒光強(qiáng)度先增后減,LA-110-Lac的熒光強(qiáng)度達(dá)最低,可能是LA-110-Lac的美拉德反應(yīng)程度最大,結(jié)合的乳糖最多,對(duì)色氨酸產(chǎn)生了更強(qiáng)的屏蔽效應(yīng)。

    圖3 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA內(nèi)源性 熒光的影響

    Figure 3 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the intrinsic fluorescence intensity ofα-LA

    2.4 表面疏水性測(cè)定

    圖4為α-LA的表面疏水性指數(shù),經(jīng)DHPM改性后,LA-80、LA-110和LA-140的H0較N-LA顯著增大(P<0.05)。這和Ruan等[17]的研究結(jié)果一致,可能是壓力作用使α-LA構(gòu)象發(fā)生變化,內(nèi)部疏水性基團(tuán)部分暴露,H0增大。但經(jīng)140 MPa處理后,H0相較110 MPa處理有所下降,可能是蛋白質(zhì)分子之間存在疏水作用,當(dāng)暴露的疏水基團(tuán)較多時(shí),會(huì)通過(guò)疏水作用重新聚合[19]。處理后的α-LA與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后,LA-Lac的H0較LA的顯著增加(P<0.05),且隨著壓力的逐漸增加,H0先顯著增加后降低(P<0.05)。這可能是α-LA與乳糖發(fā)生接枝反應(yīng),α-LA 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,暴露了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)[20],掩蓋了周?chē)挠H水性基團(tuán)[21],增加了H0。當(dāng)壓力達(dá)到110 MPa,LA-110-Lac的H0達(dá)到最大值。

    不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA表面 疏水性的影響

    Figure 4 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the surface hydrophobicity ofα-LA

    2.5 圓二色光譜分析

    采用圓二色光譜分析α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)中各組分的含量。由圖5可知,DHPM預(yù)處理對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)中各組分的含量沒(méi)有顯著影響,與Subirade等[22]的結(jié)論相似;這也可能是α-LA 結(jié)合鈣離子,使其二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[23]。美拉德反應(yīng)后的結(jié)果見(jiàn)圖6和表1,α-LA的α-螺旋含量升高、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量降低,但樣品LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分之間沒(méi)有明顯差別,可能是因?yàn)椴煌膲毫μ幚矸绞綄?duì)α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不大。此外Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分變化與還原糖的分子量、蛋白質(zhì)和還原糖的質(zhì)量比、美拉德反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。說(shuō)明LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯可能是樣品發(fā)生美拉德反應(yīng)的條件一樣。

    圖5 DHPM處理對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Figure 5 Effect of DHPM treatment on the secondary structure of α-LA

    圖6 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA二級(jí) 結(jié)構(gòu)的影響

    Figure 6 Effect of DHPM pretreatment combined with Maill-ard reaction on the secondary structure ofα-LA

    表1 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響?Table 1 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the secondary structure content of α-LA %

    ? 同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    2.6 乳化性測(cè)定

    食品中蛋白質(zhì)的乳化性一般通過(guò)乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)來(lái)評(píng)價(jià)。圖7為DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA乳化性的影響。經(jīng)DHPM預(yù)處理后,α-LA的EAI和ESI呈先升后降的趨勢(shì),當(dāng)處理壓力達(dá)到110 MPa,LA-110的乳化性最大。這可能是DHPM的瞬時(shí)高壓作用,使得蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,極性側(cè)鏈的水合作用增強(qiáng),親水性提高;與此同時(shí)一些原先被包埋在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái),親油性增強(qiáng),兩者達(dá)到較好的平衡,乳化性能增強(qiáng)[25]。但當(dāng)壓力高于110 MPa時(shí),α-LA形成分子聚集體,表面疏水性減弱,水油平衡能力減弱,乳化能力下降。經(jīng)乳糖美拉德后,α-LA的乳化性顯著增大(P<0.05),可能是α-LA與乳糖產(chǎn)生高分子量的糖結(jié)合物,它能與疏水性蛋白質(zhì)共軛結(jié)合,并牢固地吸附在水-油界面,同時(shí)親水性的糖類(lèi)物質(zhì)可以高度溶解于水相介質(zhì),從而提高蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)[26]。當(dāng)DHPM處理壓力達(dá)到110 MPa時(shí),LA-110-Lac的EAI和ESI最大。這可能是110 MPa時(shí),美拉德反應(yīng)程度最大,蛋白質(zhì)接枝上更多的糖類(lèi),生成更多的美拉德產(chǎn)物。當(dāng)壓力超過(guò)110 MPa,美拉德反應(yīng)程度降低,產(chǎn)生較少的蛋白質(zhì)-糖結(jié)合物,EAI和ESI值降低。

    不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖7 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA乳化性的影響

    Figure 7 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the emulsibility properties ofα-LA

    2.7 ABTS+·清除能力

    ABTS+·清除能力可以反映美拉德產(chǎn)物的抗氧化活性。不同DHPM處理壓力結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA的ABTS+·清除能力影響見(jiàn)圖8。經(jīng)DHPM預(yù)處理后,α-LA的ABTS+·清除能力沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明DHPM對(duì)α-LA的ABTS+·清除能力沒(méi)有顯著影響。而經(jīng)乳糖美拉德后α-LA的ABTS+·清除能力顯著提高(P<0.05),可能是α-LA與乳糖產(chǎn)生的美拉德產(chǎn)物和ABTS+·反應(yīng),使得α-LA體系的正離子自由基含量減少,導(dǎo)致蛋白質(zhì)

    不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖8 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA 抗氧化活性的影響

    Figure 8 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the antioxidative activity ofα-LA

    的抗氧化能力增加[27]。隨著DHPM壓力的增加,ABTS+·清除能力先增加后降低,處理壓力為110 MPa時(shí),LA-110-Lac的自由基清除率達(dá)到最大,這是由于DHPM促進(jìn)了α-LA 與乳糖的美拉德反應(yīng),生成更多的美拉德產(chǎn)物。當(dāng)處理壓力為140 MPa,美拉德反應(yīng)程度降低,生成的美拉德產(chǎn)物含量減少,且文獻(xiàn)報(bào)道色氨酸具有自由基清除能力,而美拉德反應(yīng)的加熱條件會(huì)降低色氨酸的自由基清除能力[28],因此LA-140-Lac的自由基清除率降低。

    3 結(jié)論

    DHPM預(yù)處理對(duì)α-LA的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響,而對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)有顯著影響。經(jīng)DHPM預(yù)處理后α-LA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度和表面疏水性增大,且呈先升后降的趨勢(shì),在處理壓力為110 MPa的條件下達(dá)到最大。說(shuō)明DHPM能改變?chǔ)?LA的三級(jí)結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露,使其乳化性增強(qiáng)。相對(duì)N-LA,DHPM預(yù)處理結(jié)合乳糖美拉德改性后的α-LA,其乳化性和抗氧化活性增強(qiáng),且隨著處理壓力的增大,呈先升高后降低的趨勢(shì),在處理壓力為110 MPa時(shí),乳化性和抗氧化活性最大。DHPM的作用使α-LA結(jié)構(gòu)松馳,更易與乳糖結(jié)合,促進(jìn)了美拉德反應(yīng),生成更多的美拉德產(chǎn)物,能更加牢固地吸附在水-油界面,增強(qiáng)乳化性;能和ABTS+·反應(yīng),減少正離子自由基,增強(qiáng)抗氧化活性。DHPM預(yù)處理結(jié)合乳糖美拉德反應(yīng)可以改變?chǔ)?LA結(jié)構(gòu)并提高其乳化性能和抗氧化活性,可以為α-LA改性提供一種新的方法。

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