四倍體果桑嘉陵30號再生植株的研究*

植　爽　任艷紅　唐 星　徐鳳翔　王茜齡　趙愛春

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶　400715)

傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)是以栽桑葉養(yǎng)蠶為主要目的，桑樹不結(jié)桑果或者果粒小而少。隨著蠶桑產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級，轉(zhuǎn)變發(fā)展觀念，主動融入大農(nóng)業(yè)，立桑為業(yè)，多元發(fā)展，建立現(xiàn)代蠶桑產(chǎn)業(yè)體系將是蠶桑產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的方向。自古以來，干桑椹都列入了中藥材，桑果又以其獨(dú)特的口味和豐富的營養(yǎng)成為一種新興的水果品種和保健品[1-2]，且果桑具有觀光價值和采摘樂趣，因此果桑產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭，生產(chǎn)上對果桑品種的需求日益強(qiáng)烈。嘉陵30號(MorusatropupureaRoxb.)是2009年通過多倍體育種育成的四倍體果桑品種，果粒大、葉片厚，且屬于果葉兼用型，并通過重慶市蠶桑品種審定委員會審定[3]，目前正以嫁接的繁殖方式在全國推廣。但嫁接繁殖存在繁殖系數(shù)低，受季節(jié)影響大，容易傳染病害，優(yōu)良種質(zhì)難以延續(xù)等缺點(diǎn)，很大程度上限制了優(yōu)良果桑的推廣和利用。而建立嘉陵30號的快速繁殖體系，可以克服上述嫁接繁殖缺點(diǎn)，不受季節(jié)影響，繁殖速度快，保持品種優(yōu)良特性，對工廠化育苗，加快優(yōu)良品種的繁殖推廣具有重要意義。因此本研究以嘉陵30號的春芽和冬芽為外植體，建立嘉陵30號的快速繁殖體系。

桑樹為多年生木本植物，離體再生較為困難，主要表現(xiàn)在污染嚴(yán)重、易褐化、不增殖、不分化、不生根等[4]。不同桑種質(zhì)材料對植物激素的敏感性以及植株的再生能力存在很大的差異[5]。冬芽是桑樹組織培養(yǎng)較為理想的外植體，易消毒，操作方便，但冬芽休眠，取材時間短，且內(nèi)生菌豐富，而春芽帶菌少生長快。因此本研究擬通過以四倍體果桑品種嘉陵30號春芽和冬芽為外植體建立高頻再生體系，有利于桑資源的合理利用，為快速繁殖優(yōu)良果桑，豐富果桑種質(zhì)資源，分子改良果桑品種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

嘉陵30號是西南大學(xué)育成的四倍體果桑品種，于2009年通過重慶市品種審定委員會審定；2016年4月中旬晴天采集取健康無病蟲害的嘉陵30號萌發(fā)的春芽為外植體。2016年12月中旬，選取健康無病蟲害的嘉陵30號一年生枝條上的冬芽為外植體。

1.2　春芽組織培養(yǎng)

將桑樹春芽先用洗潔精浸泡3min，自來水沖洗1h，75%乙醇消毒30s，無菌水洗6次，0.1% HgCl2處理9min，無菌水洗6次。切去基部，接種至培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分為MS+3.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.6g/L MES +7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH 5.8，在培養(yǎng)基中加入不同濃度氨芐青霉素鈉(Amp，Ampicillin sodium salt)和多菌靈(Car，Carbendazim)，暗處理3d后移至光照強(qiáng)度為8000Lx，14 h/d, 溫度25 ±2℃下培養(yǎng)。

1.3　冬芽解除休眠

將嘉陵30號一年生枝條隨機(jī)分為4組，分別用以下4種方式解除休眠：①4℃下冷藏5 d后常溫下0.5mg/L GA3溶液浸5d；②4℃下冷藏10d；③常溫 GA30.5mg/L 浸10d；④30℃下去離子H2O浸10d。

1.4　冬芽消毒

嘉陵30號0.1% HgCl2消毒時間分別為5min、8min、10min、12min、15min、20min，對照為0.1% HgCl2消毒10min。桑冬芽解除休眠后，剝?nèi)ネ饷?-4層帶有褐色的鱗片，洗潔精浸泡3min，自來水沖洗15min，75%乙醇消毒30s，無菌水洗6次，0.1% HgCl2中滴加2滴吐溫80處理，無菌水洗6次。再剝至剩約3層鱗片，接種在培養(yǎng)基中萌發(fā)。培養(yǎng)基同春芽培養(yǎng)基。以上實(shí)驗(yàn)中，每個處理接6瓶，每瓶接5個，共30個冬芽。

1.5　繼代增殖培養(yǎng)

嘉陵30號冬芽萌發(fā)獲得無根苗和不定芽后，在無菌條件下把莖段切成一節(jié)一葉，頂芽帶1-2片葉子，接種在增殖培養(yǎng)基中，另外切下不定芽直接接種在增殖培養(yǎng)基中。根據(jù)前人研究結(jié)果[6]，稍加修改，嘉陵30號增殖培養(yǎng)基為(1)MS+3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.6g/L MES +7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.8;(2)MS+3.0mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.6g/L MES +7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.8。每瓶5個莖段，共5瓶。30d后觀察生長情況，并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.6　不定根的誘導(dǎo)及移栽

選取嘉陵30號生長健壯的幼苗，分別接種于生根培養(yǎng)基如表1 A-D進(jìn)行生長素種類的篩選，30d后觀察生根情況并統(tǒng)計(jì)生根率。根據(jù)篩選的最適生長素種類再進(jìn)行濃度篩選，培養(yǎng)基如表1E-H，25d后觀察生根情況并統(tǒng)計(jì)生根率。生根實(shí)驗(yàn)中，每瓶接4株，每個重復(fù)4瓶，培養(yǎng)基中附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，pH 5.8。待生根以后將組培瓶從溫室移出至自然條件下開蓋放置3d進(jìn)行馴化移栽。流水洗凈植株培養(yǎng)基后，浸泡于濃度為0.1%(w/v)的多菌靈中3min后移栽至營養(yǎng)土中(腐殖質(zhì)與土3∶1)，20d后觀察其生長情況。

表1　嘉陵30號不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)基

2　結(jié)果與分析

2.1　桑春芽組織培養(yǎng)

嘉陵30號春芽接種第3d未見污染，此后在芽的基部逐漸出現(xiàn)污染。接種第7d，如表2，嘉陵30號出現(xiàn)大量污染，污染率為73.33%，在培養(yǎng)基中添加Amp能有效控制污染，但與此同時也會抑制春芽的萌發(fā)。多菌靈控制污染效果不顯著。接種14d時，未添加抗生素時嘉陵30號污染率高達(dá)96.67%，添加100mg/L Amp或者Car雖能控制污染，但污染率仍然較高，且部分芽體褐化死亡(圖1)。第20d，各處理中嘉陵30號污染率均達(dá)到100%。表明，以嘉陵30號萌發(fā)春芽為外植體污染嚴(yán)重，抗生素只能短期控制污染，因此不能以春芽進(jìn)行離體快速繁殖。

表2　Amp和 Car對嘉陵30號春芽組織培養(yǎng)的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著( P<0. 05)，下同。

圖1　嘉陵30號春芽培養(yǎng)14d生長情況

2.2　不同催芽方式對冬芽萌動的影響

以桑冬芽為外植體，催芽10d后，狀態(tài)如表3所述，直接用0.5mg/L GA3處理10d的冬芽伸展快，膨大，能明顯看見綠色鱗片，4℃處理5d后GA30.5mg/L處理5d和常溫下ddH2O處理效果次之，芽略微膨大，剝2-3層鱗片后能見綠色鱗片。只用低溫4℃下處理的冬芽變化不明顯，多層鱗片仍為褐色。將冬芽接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)14d后觀察冬芽萌動狀態(tài)如圖2所示。4℃處理5d后GA30.5mg/L處理5d效果最好，生長速度最快，形態(tài)最好，新葉長出最多；去離子水H2O處理10d效果次之，生長較快，鱗片卷曲； 常溫下GA30.5mg/L處理10d雖然催芽效果好，但對于后期無菌培養(yǎng)時生長緩慢，萌芽數(shù)較少，個別芽褐化死亡，且后期逐漸出現(xiàn)玻璃化。綜上，4℃處理5d后GA30.5mg/L處理5d適合桑冬芽解除休眠。嘉陵30號培養(yǎng)30d生長情況如圖3所示，冬芽萌發(fā)后直接長成幼苗。

A.4℃下冷藏5 d后0.5mg/L GA3 溶液浸5d；B.4℃下冷藏10d； C.常溫 GA3 0.5mg/L浸10d； D.30℃下去離子水H2O浸 10d

圖3　嘉陵30號的冬芽初代培養(yǎng)

處理方式發(fā)芽狀態(tài)生長速度A冬芽略微膨大,剝2-3層鱗片后能見綠色鱗片生長最快,脫苞芽最多,長出新葉最多,形態(tài)最好B冬芽變化不明顯,多層鱗片仍為褐色生長較慢,脫苞芽較少,部分長出綠色葉片,形態(tài)較差C冬芽膨大,長出綠色鱗片生長緩慢,萌芽數(shù)最少,形態(tài)最差,稍有褐化現(xiàn)象D冬芽略微膨大,剝2-3層鱗片后能見綠色鱗片生長較快,脫苞芽較多,有綠色葉片長出,較小,鱗片卷曲,形態(tài)較好

2.2　桑冬芽污染控制

嘉陵30號桑冬芽接種10d后，其污染及萌動狀況如表4所示，0.1% HgCl2不同消毒時間處理外植體的效果存在差異。消毒5-10min，污染率均為100%，芽體四周菌生長旺盛，芽死亡較多，因此導(dǎo)致萌發(fā)率較低。HgCl2處理時間在12-20min時，HgCl2浸泡時間越長，冬芽污染率越低，但HgCl2消毒20min時，部分冬芽死亡，其萌發(fā)率明顯降低，僅為16.67%。綜合考慮，以0.1% HgCl2消毒時間15min為最佳，其污染率和萌發(fā)率均為60%。在培養(yǎng)基中添加300mg/ml Cef后，其污染率明顯降低，芽萌發(fā)率也略微降低。

2.3　增殖培養(yǎng)

將嘉陵30號冬芽萌發(fā)的無根苗切下帶一個腋芽的莖段接種在含細(xì)胞分裂素6-BA的培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，無根苗長勢好，莖粗，節(jié)間短。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，嘉陵30號的莖段繼代增殖系數(shù)為6.84(表5，圖4B)；在含有細(xì)胞分裂素KT的培養(yǎng)基中增殖時，植株細(xì)長，節(jié)間距大，嘉陵30號的增殖系數(shù)為4.24(表5，圖4A)；以嘉陵30號冬芽萌發(fā)以后的不定芽增殖培養(yǎng)，幼苗健壯，增殖系數(shù)為7.03(表5，圖4C)。

表4　消毒時間和Cef對冬芽染菌和萌發(fā)的影響

表5　嘉陵30號的莖段增殖

表6　嘉陵30號的不定芽增殖

A.莖段在KT培養(yǎng)基上增殖；B.莖段在6-BA培養(yǎng)基上增殖；C.叢生芽在6-BA號培養(yǎng)基上的誘導(dǎo) 圖4　嘉陵30號冬芽的繼代培養(yǎng)

2.4　生根

為探究適合嘉陵30號生根的培養(yǎng)基，以1/2MS培養(yǎng)基為對照，比較NAA、IBA和IAA對其生根的影響，結(jié)果如圖5和表7所示，1/2MS培養(yǎng)基上根系較少，生長素IAA能促進(jìn)嘉陵30號不定芽生根，愈傷組織少，根系較多，生根率為43.75%。生長素NAA誘導(dǎo)無根苗切口處形成愈傷組織，根系較少。生長素IBA最差，幼苗切口處形成大量的黃褐色愈傷組織，生長受抑制，嚴(yán)重發(fā)黃致死，生根率低且根系短。對照(無生長素)，幼苗葉片更綠。結(jié)果顯示IAA能促進(jìn)根系誘導(dǎo)。因此為進(jìn)一步優(yōu)化嘉陵30號幼苗生根的培養(yǎng)基，降低IAA濃度至0.1-0.4mg/L，篩選最適IAA濃度。分別將幼苗接種培養(yǎng)25d以后。結(jié)果如圖6和表8可知，IAA濃度為0.1mg/L和0.2mg/L時，幼苗生長狀況相似，葉片綠色，健壯，根系發(fā)達(dá)。IAA濃度為0.3mg/L和0.4mg/L時，幼苗長勢相似，略微發(fā)黃。IAA濃度為0.2mg/L時生根率最高，主根最長，須根最多；IAA濃度為0.1次之，而IAA濃度為0.4mg/L時，幼苗最為矮小，即1/2MS+0.2mg/L IAA為嘉陵30號的最適生根培養(yǎng)基。

A.1/2MS　B.1/2MS+IBA　C. 1/2MS+NAA　D. 1/2MS+IAA

培養(yǎng)基類型生根率/%總主根數(shù)生長情況1/2MS37.50ab14b+++1/2MS+IBA0.06c4bc+1/2MS+NAA25.00bc12bc++1/2MS+IAA43.75a37a++

注：+++表示植株蔥綠，形態(tài)好；++表示植株略微發(fā)黃；+表示植株矮小，葉片較黃。下同。

A．0.1mg/L IAA　B. 0.2 mg/L IAA　C. 0.3 mg/L IAA　D. 0.4 mg/L IAA

IAA濃度(mg/L)主根總數(shù)生根率/%平均根長/cm生長情況0.148a75.00a1.26b+++0.255a87.50a1.63a+++0.364a81.25a0.87c++0.467a75.00a0.71c+

圖7　嘉陵30號移栽后生長情況

2.5　煉苗與移栽

嘉陵30號移栽20d(圖7)存活率均為100%，長勢良好，平均株高為5.07cm。

3　討論

譚志一等(1985)研究認(rèn)為GA3能促進(jìn)毛白楊(PopulustomentosaCarrière)的冬芽解除休眠[7]。本次試驗(yàn)表明，低溫4℃下處理10d的冬芽變化不明顯，這與八尋正樹和羅國慶的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為，進(jìn)入最深休眠期的枝條，需冷藏15d后才能解除休眠。GA3促進(jìn)桑樹冬芽休眠解除，高溫(30℃)下10d能解除休眠[8]，因此30℃下GA3處理10d最適桑冬芽解除休眠。王海波等研究認(rèn)為45℃和50℃高溫分別處理對油桃(Prunuspersicavar.nectarina)芽自然休眠呈正調(diào)控效應(yīng)，推測對于解除桑冬芽休眠，還可以提高溫度促進(jìn)休眠解除[9]。在培養(yǎng)過程發(fā)現(xiàn)，低溫(4℃)冷藏5d以后再用赤霉素GA3處理5d的冬芽生長速度更快，形態(tài)更好，新葉長出更多，30℃下GA3處理10d的冬芽產(chǎn)生褐化且伴有玻璃化現(xiàn)象，這可能是低溫能促進(jìn)冬芽的生長，也可能是赤霉素處理時間過長，導(dǎo)致了冬芽細(xì)胞的過度生長[10]。

桑樹是多年生木本植物，雜菌多，外植體表面不光滑，含有內(nèi)生菌，消毒困難，污染率高。常采用滅菌方式是自來水下沖洗15-20min，在超凈工作臺上用75%乙醇振蕩消毒15s，倒去乙醇后隨即加入0.1% HgCl2消毒5-15min[11-13]。果桑嘉陵30號芽內(nèi)生菌污染嚴(yán)重，冬芽比春芽能能耐受HgCl2消毒，0.1%HgCl2消毒15min可以用于嘉陵30號冬芽離體再生，但污染率仍然很高，0.1% HgCl2不能除掉內(nèi)生菌，需要結(jié)合抗生素才能有效控制污染，在培養(yǎng)基中加入300mg/ml Cef后，能有效控制污染。而春芽消毒時，抗生素Amp和殺菌劑Car對嘉陵30號污染控制沒有效果。秦宇等研究了不同抗生素對南方紅豆杉(TaxusmaireiSYHu)內(nèi)生菌抑制研究，認(rèn)為抗生素能有效抑制組織材料中內(nèi)生菌，并且不同抗生素對內(nèi)生菌抑制效果不一致[14]。因此嘉陵30號污染除了內(nèi)生細(xì)菌外還存在內(nèi)生真菌，需要進(jìn)一步研究真菌類抗生素對嘉陵30號污染控制的影響。

桑樹組織培養(yǎng)過程中器官發(fā)生受材料，生長激素，培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，桑樹在合適的條件下可以通過直接器官發(fā)生途徑或間接器官發(fā)生途徑進(jìn)行再生[15]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嘉陵30號再生過程中不產(chǎn)生愈傷組織，屬于典型的直接器官發(fā)生途徑再生。Chattopadhyay曾報道三倍體桑相比二倍體桑樹的生根需要更多激素[16]，四倍體的嘉陵30號需要添加一定的生長素才能較好地生根，不同生長素效應(yīng)不同，其中以IAA最好，NAA次之，IBA最差。高濃度的IAA雖能誘導(dǎo)出大量的不定根，但抑制了根的伸長。但在前人研究研究中，桑樹生根培養(yǎng)最常用的生長素為IBA，NAA次之[17-19]。較少報道IAA誘導(dǎo)桑樹生根。推測可能因?yàn)樗谋扼w果桑嘉陵30號是通過雜交育種與人工誘導(dǎo)多倍體相結(jié)合育成的，基因型復(fù)雜的遺傳特異性所致。

4　結(jié)論

本研究成功建立了嘉陵30號桑的快繁體系，四倍體果桑嘉陵30號內(nèi)生菌污染嚴(yán)重，春芽不適合作外植體，冬芽可通過低溫和赤霉素結(jié)合解除休眠以后作為外植體，培養(yǎng)基加入300 mg/L Cef可有效控制污染，激素6-BA比KT更適合嘉陵30號的增殖培養(yǎng)，生長素IAA能有效促進(jìn)生根，其再生途徑屬于直接器官發(fā)生途徑，經(jīng)過馴化移栽至土后，嘉陵30號存活率高達(dá)100%。