長葉紅砂RtMYB1基因的克隆及表達(dá)

杜 超，孫曉梅，王迎春,鄭琳琳

(牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點實驗室 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

非生物脅迫如極端溫度、鹽漬、干旱和化學(xué)污染等經(jīng)常影響植物的正常生長發(fā)育，導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降[1]。植物經(jīng)過長期進(jìn)化，逐漸形成了多種復(fù)雜機制以應(yīng)對各種逆境脅迫[2-5]。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控體內(nèi)抗逆相關(guān)功能基因的表達(dá)，引發(fā)多重抗逆相關(guān)生理生化反應(yīng)，最終減少、消除逆境造成的危害[6-9]。多項研究發(fā)現(xiàn)，HSF[10]、CBF/DREB[11-12]、ABF/ABAE[13]、WRKY[14]、MYB[15]、WOX[16]等轉(zhuǎn)錄因子家族具有調(diào)控植物生長發(fā)育、次級代謝和響應(yīng)逆境脅迫的功能。

植物中的MYB蛋白家族成員均含一個高度保守的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即MYB結(jié)構(gòu)域。這個結(jié)構(gòu)域由MYB轉(zhuǎn)錄因子N端的含有約52個氨基酸構(gòu)成的1～4個串聯(lián)的、不完全重復(fù)序列組成，通過折疊成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(Helix-Turn-Helix,HTH)的形式參與與DNA大溝的結(jié)合[17-18]。Clorless1(C1)基因是最早從玉米(Zeamays)中被克隆的植物類MYB轉(zhuǎn)錄因子[19]，隨后,更多的MYB轉(zhuǎn)錄因子從金魚草(Antirrhinummajus)[20]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[21]、茄子(Solanummelongena)[22]、淫羊藿(Epimediumsagittatum)[23]等植物中分離和鑒定出來。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物調(diào)控激素應(yīng)答、次級代謝以及響應(yīng)各種生物脅迫、非生物脅迫等生理活動中都扮演重要的角色。MYB轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控激素應(yīng)答從而提高植物抗逆性，例如，在干旱條件下，擬南芥中的MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB2和AtMYB37被誘導(dǎo)表達(dá)，通過調(diào)控脫落酸(ABA)的含量或增加對ABA的敏感性，提高了植株的抗逆性[24-25]；MYB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控植物的次級代謝從而提高植物抗逆性，如將毛白楊(Populustomentosa)PtoMYB170基因轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量增加，黑暗中氣孔閉合增強，水分流失降低，最終提高了植株的抗旱能力[26]；此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子也可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控其體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)來響應(yīng)逆境脅迫，如小麥(Triticumaestivum)中TaSIM編碼的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可以被干旱、高鹽、低溫和ABA處理誘導(dǎo)，將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株中ABA依賴型(RD22)和ABA非依賴型(RD29A)的逆境應(yīng)答基因均上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而提高其耐鹽性[27]。

長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)，又名黃花紅砂、黃花琵琶柴，屬于檉柳科(Tamaricaceae)，琵琶柴屬，為古地中海孑遺植物，是亞洲中部東阿拉善-西鄂爾多斯地區(qū)特有珍稀泌鹽植物[28-30]，被稱為“活化石”，是內(nèi)蒙古自治區(qū)的重點保護(hù)植物[31]。東阿拉善-西鄂爾多斯地區(qū)為典型的戈壁荒漠區(qū)，具有高鹽、干旱和嚴(yán)寒等環(huán)境特點[32-33]。長葉紅砂因特有的劈裂生長、圓柱形肉質(zhì)化葉片、活力高耐儲存的種子等形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特征，具有極強的生境適應(yīng)性，常被作為鹽堿地改良和防風(fēng)固沙的先鋒植物[34-35]。2013年Dang等[32]利用Illumina測序技術(shù)對長葉紅砂植株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組深度測序，結(jié)果顯示，離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因、活性氧清除系統(tǒng)基因和轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫前后表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，表明長葉紅砂具有高效的離子平衡機制和抗氧化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子可能在長葉紅砂響應(yīng)鹽脅迫的過程中發(fā)揮了積極的調(diào)控作用。Du等[36]的研究證實，長葉紅砂RtWRKY1的過量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。MYB作為另一大類抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，極有可能參與長葉紅砂逆境應(yīng)答過程。然而，目前關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在擬南芥、棉花(Anemonevitifolia)、番茄(Lycopersiconesculentum)、水稻(Oryzasativa)等模式植物或農(nóng)作物中，野生抗逆植物的相關(guān)報道并不多見?；陂L葉紅砂鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究選取一個注釋為MYB轉(zhuǎn)錄因子且在鹽處理后表達(dá)顯著上調(diào)的Unigene，將其命名為RtMYB1，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，將有助于進(jìn)一步探索該基因的調(diào)控作用,以及深入理解長葉紅砂的抗逆機理。

1　材料和方法

1.1　材料

長葉紅砂種子于2015年10月采自內(nèi)蒙古烏海市青年橋，經(jīng)曬干后室溫貯藏備用。

植物總RNA提取試劑盒RNA Plant Plus購自北京天根生化科技有限公司；第一鏈合成試劑盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA synthesis kit、PrimeScriptTM RT Master Mix購自TaKaRa公司。引物合成及常規(guī)測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2　方法

1.2.1長葉紅砂幼苗培養(yǎng)及脅迫處理挑選飽滿長葉紅砂種子，10% NaClO浸泡10～15 min，滅菌ddH2O清洗3～5次，播種于含有40 mL MS培養(yǎng)基的三角瓶中，暗培養(yǎng)3 d后，在25 ℃、相對濕度70%，光周期為16 h光照/8 h黑暗條件下生長。待幼苗高約10 cm時，轉(zhuǎn)移至內(nèi)含50 mL 1/2 Hoagland營養(yǎng)液的大試管中培養(yǎng)，間隔3 d更換一次營養(yǎng)液。

在大試管中繼續(xù)培養(yǎng)1個月，選取長勢一致的幼苗，分別用30% PEG-6000、紫外照射(UV)、4 ℃及42 ℃、不同濃度 NaCl(200、400、600 mmol·L-1)處理0、3、6、12和24 h，采集葉片后經(jīng)液氮速凍，貯存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2RNA的提取及cDNA的合成長葉紅砂總RNA的提取參照天根RNA Plant Plus植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。采用DNase I(RNase-free)消化RNA樣本中的殘余DNA，分別用NanoVue Plus微量紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和完整性。

基因克隆所需的cDNA合成參照TaKaRa公司的PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA synthesis kit試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系20 μL，首先在PCR管依次加入1 μL Random 6 mers，1 μL dNTP Mixture，1 μL長葉紅砂RNA，7 μL RNase free dH2O，65 ℃反應(yīng)5 min后冰上迅速冷卻；隨后繼續(xù)加入4 μL 5× PrimeScript Ⅱ Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor，1 μL PrimeScript Ⅱ RTase，4.5 μL RNase free ddH2O，緩慢搖勻，30 ℃孵育10 min，42 ℃反應(yīng) 60 min，95 ℃保溫5 min；最后冰浴冷卻獲得長葉紅砂cDNA。

熒光定量PCR(Real Time quantitative PCR，qPCR)所需的cDNA合成參照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為5× Mix 2 μL，Total RNA 100 ng，最后加入ddH2O至10 μL。反應(yīng)程序為37 ℃下運行15 min，之后85 ℃運行5 s，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RtMYB1基因的克隆根據(jù)長葉紅砂高通量測序結(jié)果中功能注釋為MYB轉(zhuǎn)錄因子(Unigene 21094)的Unigene序列設(shè)計引物(表1)，以長葉紅砂cDNA為模板，克隆獲得Unigene 21094的ORF序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含2.5 μL 10× TransStart Taq buffer、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.4 μmol·L-1上下引物、1 μL TransStart Taq DNA Polymerase、1 μL cDNA。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸 30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定后進(jìn)行雙向測序。

1.2.4RtMYB1基因的生物信息學(xué)分析利用NCBI的ORF Finder識別開放閱讀框并翻譯出氨基酸序列；利用DNAMAN 6.0軟件分析蛋白的理論分子量和等電點；利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件預(yù)測蛋白二、三級結(jié)構(gòu)；蛋白序列比對用Clustal W軟件執(zhí)行；系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 5.0軟件，鄰接法(neighborjoining，N-J)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1　引物序列Table 1　Primer sequences

1.2.5RtMYB1基因的表達(dá)模式分析以cDNA作為模板進(jìn)行qPCR，用β-Actin作為內(nèi)參基因(表1)。參照Transgen公司的TransStartRTip Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR反應(yīng)參照體系為20 μL PCR，內(nèi)含2×TransStartRTip Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、54～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.3　數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果分析

2.1　RtMYB1基因ORF的克隆

根據(jù)長葉紅砂高通量測序結(jié)果中功能注釋為MYB轉(zhuǎn)錄因子(Unigene 21094)的序列設(shè)計引物，克隆獲得了780 bp的ORF序列(圖1)，編碼236個氨基酸。該基因是第1個被發(fā)現(xiàn)的長葉紅砂MYB基因，因此命名為RtMYB1。

2.2　RtMYB1基因的生物信息學(xué)分析

氨基酸序列分析顯示，RtMYB1基因編碼的蛋白具有典型的高度保守的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即MYB結(jié)構(gòu)域，屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族(圖2)。RtMYB1蛋白相對分子量26.26 KDa，等電點為8.75。氨基酸比對分析表明，同源性最高的為大豆(Glycinemax，ALA09221.1)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，KEH44287.1)，同源性為94%；其次為黃芩(Scutellariabaicalensis，AGZ16405.1)，同源性為83%；最低的為擬南芥(Arabidopsisthaliana，AAC27179.1)，同源性為74%(圖2)。

圖1　PCR凝膠電泳圖 Fig. 1　Product of PCR

M：DL2000 Maker; L1：PCR結(jié)果。

M: DL2000 Maker; L1: Product of PCR.

蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，RtMYB1蛋白的236個氨基酸中，50個是α螺旋(藍(lán)色)，占21.19%；39個是延伸鏈(紅色)，占16.53%；21個是β轉(zhuǎn)角(綠色)，占8.9%；126個是隨機卷曲(紫色)，占53.39%(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，長葉紅砂RtMYB1轉(zhuǎn)錄因子與黃芩、蓖麻(Ricinuscommunis)、麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)的親緣關(guān)系較近，與無刺棗(Ziziphusjujuba)、蘋果(Malusdomestica)的親緣關(guān)系次之，與綠豆(Vignaradiata)、野生大豆、木豆(Cajanuscajan)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

2.3　RtMYB1基因的定量分析

植物基因在受到不同的生物及非生物脅迫時會誘導(dǎo)發(fā)生不同的生理代謝功能以抵御脅迫，所以基因的表達(dá)模式也不同。為了了解RtMYB1基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式，利用qPCR對RtMYB1基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，該基因在不同梯度鹽脅迫處理時，相較對照均表現(xiàn)出表達(dá)量上升的趨勢，且在脅迫3 h時達(dá)到峰值(圖5)；在其他脅迫條件下，冷(4 ℃)和UV處理表達(dá)模式較為接近，3 h處理時基因表達(dá)量最高，然后下降，在脅迫晚期(12-24 h)表達(dá)量又呈現(xiàn)出上升的情況；高溫(42 ℃)脅迫處理6 h后出現(xiàn)表達(dá)量的高峰；而干旱脅迫(PEG)處理后，RtMYB1基因的表達(dá)量隨脅迫時間的延長整體趨勢呈現(xiàn)持續(xù)上升的狀態(tài)(圖6)。研究結(jié)果表明RtMYB1基因的表達(dá)受鹽(NaCl)、冷(4 ℃)、高溫(42 ℃)、UV和干旱(PEG)5種非生物脅迫的誘導(dǎo)，且不同處理間RtMYB1基因的表達(dá)量存在差異，因此推測，RtMYB1轉(zhuǎn)錄因子在長葉紅砂響應(yīng)非生物脅迫過程中可能起到了積極調(diào)控作用。

圖2　RtMYB1的氨基酸序列比對Fig. 2　Comparison of the amino acid sequence of RtMYB1

GmMYB：大豆Glycinemax(ALA09221.1)；MtMYB：蒺藜苜蓿Medicagotruncatula(KEH44287.1)；SbMYB：黃芩Scutellariabaicalensis(AGZ16405.1)；AtMYB：擬南芥Arabidopsisthaliana(AAC27179.1)。-：MYB 的DNA結(jié)合序列MYB DNA-binding sequence(10-53；113-157)。

圖3　RtMYB1蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3　The predicted secondary and tertiary structures of RtMYB1

圖4　RtMYB1蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4　The phylogenetic tree of RtMYB1

圖5　RtMYB1基因在鹽脅迫下的表達(dá)量變化Fig. 5　Changes in expression levels of RtMYB1 gene under salt-based abiotic stress

圖6　RtMYB1基因在其他脅迫下的表達(dá)量變化Fig. 6　Changes in expression levels of RtMYB1 gene under other abiotic stress

3　討論與結(jié)論

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物抵抗非生物脅迫過程中起重要作用的一類調(diào)控因子，可以通過調(diào)控植物的生長發(fā)育、次級代謝、植物激素介導(dǎo)的防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程來提高植物的耐受性[37]。本研究基于長葉紅砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從長葉紅砂中分離獲得RtMYB1基因，氨基酸序列分析顯示這個基因具有典型的MYB結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，RtMYB1蛋白與野生植物黃芩、蓖麻和麻風(fēng)樹的親緣關(guān)系較近，而與農(nóng)作物蘋果和綠豆的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 4)。因此，相較于農(nóng)作物的MYB轉(zhuǎn)錄因子，RtMYB1蛋白的生物學(xué)功能可能與野生植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子功能更相似。

作為植物響應(yīng)逆境脅迫過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠快速被多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，從而及時發(fā)揮其調(diào)控作用，使得植物能夠迅速適應(yīng)逆境。已有的研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmMYB76、GmMYB92和GmMYB177可以被鹽、冷和干旱這些非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但是 ABA 處理表達(dá)量無明顯變化[38]。水稻OsMYB2則在鹽、冷和干旱脅迫以及ABA 處理下均可被誘導(dǎo)表達(dá)[39]。此外，Ding等[40]發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtMYB15超表達(dá)植株具有更抗干旱、抗鹽的特性且對ABA超敏感。長葉紅砂RtMYB1轉(zhuǎn)錄因子在鹽(NaCl)、冷(4 ℃)、高溫(42 ℃)、UV和干旱(PEG)5種非生物脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)，這些脅迫條件與長葉紅砂高鹽、干旱、冬季嚴(yán)寒、夏季酷熱、日照強烈的生境吻合，結(jié)果顯示RtWRKY1的表達(dá)在該植物適應(yīng)嚴(yán)酷生境發(fā)表發(fā)揮著作用。值得注意的是，該基因快速響應(yīng)鹽、冷和UV(3 h)脅迫，較晚響應(yīng)干旱脅迫(12、24 h)和高溫脅迫(12 h)，表明RtMYB1基因可能通過不同機制參與長葉紅砂響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)節(jié)途徑，需要進(jìn)一步的研究證實。