藍(lán)莓果渣發(fā)酵乳飲料工藝研究

王俊穎，　關(guān)仁梅，　談雪潔，　吳文娟，　夏敬宇，　翟立公

(安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院， 安徽 鳳陽(yáng)　233100)

藍(lán)莓,又稱藍(lán)漿果、越橘,屬杜鵑花科，含有大量的天然色素，果實(shí)中的花青素和超氧化歧化酶的含量普遍高于其他植物[1-2]。我國(guó)有豐富的野生藍(lán)莓資源，藍(lán)莓飲料行業(yè)正是利用這一優(yōu)勢(shì)，對(duì)藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行初級(jí)的加工，充分利用藍(lán)莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。藍(lán)莓渣為藍(lán)莓取汁后剩余的廢料，其中含有較多的花青素和膳食纖維，具有很高的利用價(jià)值[3-5]。花青素(Anthocyanin)是水溶性的植物色素，是黃酮類代謝途徑的分支產(chǎn)物。游離狀態(tài)的花青素在自然狀態(tài)下極為少見，同時(shí)花青素的提取也十分困難，主要以糖苷形式存在，花青素是一種小分子物質(zhì)容易被人體吸收利用。保加利亞乳桿菌，屬于乳酸桿菌，因其菌種產(chǎn)地、微生物特性、效能優(yōu)異等特點(diǎn)，被微生物學(xué)家命名為德氏乳桿菌保加利亞亞種[6-7]?；ㄇ嗨?Anthocyanin)是水溶性的植物色素，是黃酮類代謝途徑的分支產(chǎn)物。游離狀態(tài)的花青素在自然狀態(tài)下極為少見，同時(shí)花青素的提取也十分困難，主要以糖苷形式存在，花青素是一種小分子物質(zhì)容易被人體吸收利用。發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的乳酸，可以促進(jìn)胃內(nèi)容物排空，減少胃酸的分泌，有助于鈣、鐵、磷的利用率，抑制胃腸道中的有害細(xì)菌，促進(jìn)腸道的健康[8-9]。同時(shí)，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物，例如多糖、有機(jī)酸和乳鏈球菌胎等產(chǎn)物有助于改善人體的免疫力，調(diào)節(jié)胃腸道生態(tài)環(huán)境防止致病菌的侵入。乳酸菌飲料通常是以脫脂奶粉或牛乳為原料，配以果蔬、糖類、植物蛋白為輔料通過發(fā)酵制得的一種發(fā)酵型的酸性含乳飲料[10-11]。本研究是利用藍(lán)莓渣中添加保加利亞乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，開發(fā)出一種富含花青素及乳酸菌的保健型活菌發(fā)酵飲料。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)莓渣粉(安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)；伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉(伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司)；食用葡萄糖(AR,國(guó)藥集團(tuán))；MRS固體培養(yǎng)基(青島海博生物科技有限公司)。菌種：德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌GDMCC 1.155。HI98103 pH計(jì)(上海希慶電子科技有限公司)；DHG-9101-3SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；NGP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市全程國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；722型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；XW-80A漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；自動(dòng)高壓滅菌鍋165/8Z(寧波久興醫(yī)療器械有限公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基本操作要點(diǎn)將藍(lán)莓渣粉、脫脂奶粉和食用葡萄糖按一定的比例混合。采用巴氏殺菌法(在62～65 ℃的溫度下滅菌30 min)以最大程度的保留藍(lán)莓渣粉中花青素的含量。經(jīng)滅菌后的待發(fā)酵液冷卻至室溫，將37 ℃ 培養(yǎng)活化后的德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌按照一定比例接種。經(jīng)過一定時(shí)間發(fā)酵后，進(jìn)行低速離心(1 000 r/min離心5 min)，去除發(fā)酵液中的藍(lán)莓渣，進(jìn)行均質(zhì)，制得發(fā)酵乳飲料成品。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)及方法活菌數(shù)的測(cè)定采用平板菌落計(jì)數(shù)法，在無菌狀態(tài)下吸取1 mL的樣液加入到9 mL滅菌且冷卻的生理鹽水中，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1 mL適當(dāng)梯度的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)，42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3次重復(fù)[12]。

利用pH計(jì)測(cè)定樣品的pH值，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

采用雙波長(zhǎng)pH值示差法測(cè)定樣品中花青素的含量[13]。該方法以矢車菊3-葡萄糖苷為參照，取1 mL樣品分別用pH=7.0的緩沖液和pH=4.5的緩沖液定容至10 mL，放置20 min，之后在510 nm和700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值[14]，代入公式中：

花青素含量(mg/ml))=(A×MW×DF×V)/(E×1)

A=(A510 nm-A700 nm)pH1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5；矢車菊3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量MW449.2；稀釋倍數(shù)DF10；E，矢車菊3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900；1，比色皿的光段長(zhǎng)度；藍(lán)莓汁的體積或提取液的總體積V(mL)。

1.2.3脫脂奶粉對(duì)發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響配料時(shí)，脫脂奶粉的添加量分別為0%、5%、10%、15%、20%和25%。藍(lán)莓渣的添加量為0.5%，食用葡萄糖的添加量為4%，接種量為0.1%，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃，根據(jù)發(fā)酵乳飲料中活菌含量、pH值及花青素含量確定最佳脫脂奶粉添加量。

1.2.4葡萄糖對(duì)發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響配料時(shí)，食用葡萄糖的添加量分別為0%、3%、6%、9%和12%。藍(lán)莓渣的添加量為0.5%，脫脂奶粉的添加量為10%，接種量為0.1%，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃。根據(jù)發(fā)酵乳飲料中活菌含量、pH值及花青素含量確定最佳食用葡萄糖添加量。

1.2.5藍(lán)莓渣對(duì)發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響配料時(shí)，藍(lán)莓渣的添加量分別為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%。脫脂奶粉的添加量為10%，食用葡萄糖的添加量為9%，接種量為0.1%，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃。根據(jù)發(fā)酵乳飲料中活菌含量、pH值及花青素含量確定最佳藍(lán)莓渣添加量。

1.2.6接種量對(duì)發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響配料時(shí)，接種量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%。脫脂奶粉的添加量為10%,藍(lán)莓渣的添加量為0.4%，食用葡萄糖的添加量為9%，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃，根據(jù)發(fā)酵乳飲料中活菌含量、pH值及花青素含量確定最佳接種量。

1.2.7發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響培養(yǎng)溫度分別取35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃和45 ℃。脫脂奶粉的添加量為10%,藍(lán)莓渣的添加量為0.4%，食用葡萄糖的添加量為9%，接種量為0.2%，培養(yǎng)時(shí)間為20 h，根據(jù)發(fā)酵乳飲料中活菌含量、pH值及花青素含量確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.8發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響培養(yǎng)時(shí)間分別取18、20、22、24和26 h。脫脂奶粉的添加量為10%,藍(lán)莓渣的添加量為0.4%，食用葡萄糖的添加量為9%，接種量為0.2%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，根據(jù)發(fā)酵乳飲料中活菌含量、pH值及花青素含量確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.9正交實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以及對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的主要限制性因素考慮，選擇脫脂奶粉的添加量、食用葡萄糖添加量、菌種的接種量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素為主要研究對(duì)象，設(shè)計(jì)5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)，以活菌數(shù)含量、pH值及花青素含量為指標(biāo)選出最佳工藝條件。因素水平編碼表見表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.10數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)表示以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，通過SPSS 16.0軟件和Origin 9.1軟件分析，方差分析的顯著性水平P=0. 05。

2　結(jié)果與分析

2.1　脫脂奶粉對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

由圖1可以看出脫脂奶粉添加量與藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料的菌落數(shù)和pH值呈正相關(guān)關(guān)系，隨著脫脂奶粉添加量的增加菌落數(shù)和pH值在逐漸上升，當(dāng)添加量達(dá)到10%時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)的上升率有所減緩；樣品中的花青素最高，達(dá)到0.524±0.057 mg/mL。根據(jù)藍(lán)莓渣乳酸活菌飲料的特點(diǎn)，需保持較高的活菌數(shù)及花青素含量，且低pH值可以保證乳飲料有較長(zhǎng)的保存期，綜述分析，確定脫脂奶粉的添加量為10%。

2.2　葡萄糖對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

由圖2所示葡萄糖添加量，對(duì)pH值和花青素含量的影響無明顯線性關(guān)系，而且波動(dòng)范圍較窄；當(dāng)葡萄糖的添加量為9%時(shí)，藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料中活菌數(shù)最高，其對(duì)數(shù)值達(dá)到10.18±0.02 lgCFU/mL。綜上考慮，選取9%的葡萄糖為最適添加量。

2.3　藍(lán)莓渣對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著藍(lán)莓渣添加量增加，樣品中花青素含量不斷提高，pH值不斷下降；當(dāng)藍(lán)莓渣添加量為0.4%時(shí)，藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料中的活菌數(shù)最高，達(dá)到10.055±0.025 lgCFU/mL，之后開始下降。保加利亞乳桿菌的最適生長(zhǎng)pH為5.0～6.2，在pH為3.0～4.5時(shí)亦能生長(zhǎng)，所以當(dāng)藍(lán)莓渣添加量過高時(shí)，保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)受到限制。綜合考慮成本與樣品品質(zhì)等因素，選擇0.4%的藍(lán)莓渣添加量最為適宜。

圖3　藍(lán)莓果渣對(duì)藍(lán)莓果渣發(fā)酵飲料活菌數(shù)、pH值和花青素含量的影響

2.4　接種量對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

根據(jù)接種量的不同，以花青素含量、活菌數(shù)和pH值為指標(biāo)，測(cè)得其對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料的影響，結(jié)果見圖4。菌種接種量的不同對(duì)發(fā)酵有一定影響，接種量過多，會(huì)影響發(fā)酵液溶氧不足，最終會(huì)影響產(chǎn)物的生成，過少則會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不利于提高產(chǎn)品的生產(chǎn)率。當(dāng)接種量為0.5%的時(shí)候活菌數(shù)最高；且此時(shí)的花青素含量也較高，達(dá)到0.342±0.036 mg/mL；此條件下的pH值，更適宜保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)，口感也較為適中。

圖4　接種量對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料活菌數(shù)、pH值和花青素含量的影響

2.5　發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

根據(jù)溫度的不同，以活菌數(shù)和pH值為指標(biāo)，測(cè)得其對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料的影響(圖5)。保加利亞乳桿菌的適宜的生長(zhǎng)溫度為40～45 ℃，50 ℃亦能生長(zhǎng)，25～35 ℃生長(zhǎng)不良，15 ℃停止發(fā)育，由圖10可知當(dāng)溫度在43 ℃時(shí)，保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)狀況均高于其他發(fā)酵溫度。此溫度下的發(fā)酵產(chǎn)品pH值僅高于35 ℃和37 ℃下的pH值相差較小，相比較該發(fā)酵溫度獲得的花青素含量較低，且適當(dāng)?shù)臏囟认聲?huì)縮短發(fā)酵的時(shí)間，故選43 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖5　發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料活菌數(shù)、pH值和花青素含量的影響

2.6　發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

根據(jù)發(fā)酵時(shí)間的不同，以活菌數(shù)和pH值為指標(biāo)，測(cè)得其對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料的影響，由圖6所示，發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致乳酸大量產(chǎn)生，降低產(chǎn)品的口感，且過長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間會(huì)導(dǎo)致資源浪費(fèi)，不利于產(chǎn)品利益化；發(fā)酵時(shí)間過短，飲料的風(fēng)味無法完全散發(fā)出來，影響口味和飲料中的活菌數(shù)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在24 h時(shí)活菌數(shù)僅低于發(fā)酵時(shí)間為15 h，但15 h時(shí)產(chǎn)品的pH值相對(duì)較高，不利于胃腸道環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而24 h的pH值時(shí)試驗(yàn)組中最低的，較為適宜，且考慮到發(fā)酵成本和其風(fēng)味的影響因此選取24 h為培養(yǎng)時(shí)間。此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到9.36 lgcfu/mL，pH值為3.67。

圖6　發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料活菌數(shù)、pH值和花青素含量的影響

2.7　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以脫脂奶粉添加量(A)、葡萄糖添加量(B)、接種量(C)，發(fā)酵時(shí)間(D)，空列(E)進(jìn)行L16(45)正交實(shí)驗(yàn)分析，通過活菌數(shù)(40%)、pH值(20%)和花青素含量(40%)等指標(biāo)綜合分析，確定藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料的最佳工藝條件。由正交實(shí)驗(yàn)和極差分析(表2)，可知四個(gè)因素對(duì)產(chǎn)品中活菌數(shù)的影響順序分別為：脫脂奶粉添加量(A)>葡萄糖添加量(B)>發(fā)酵時(shí)間(D)>空列(E)>接種量(C)。由方差分析(表3)可得，因素A顯著(P<0.05)，因素B、C、D、E相對(duì)于產(chǎn)品中活菌數(shù)指標(biāo)均不顯著。

由表2極差分析，根據(jù)以上三指標(biāo)的比例分配，獲得的最優(yōu)組合(A4B4C2D3)與試驗(yàn)組活菌數(shù)最高組合(A4B3C4D2)、pH值最高組合(A1B4C4D4)和花青素含量最高組合(A1B1C1D1)均不一致，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，每組3個(gè)重復(fù)。通過比較分析(表4)，由A4B4C2D3組合得到產(chǎn)品，其活菌數(shù)和花青素含量較高，產(chǎn)品中的pH較低。此時(shí)的產(chǎn)品風(fēng)味好，色澤淺，活菌數(shù)可以最大化保留，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過活菌數(shù)、pH值和花青素含量的方差分析可知脫脂奶粉的添加量對(duì)藍(lán)莓渣發(fā)酵飲料的各個(gè)影響均為顯著，食用葡萄糖、接種量、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均不顯著。

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

注:* 表示差異顯著(P<0. 05)。

表4　pH值的方差分析

注:* 表示差異顯著(P<0. 05)

表5　花青素含量的方差分析

注:* 表示差異顯著(P<0. 05)

表6　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論與討論

通過單因素和正交試驗(yàn)研究了藍(lán)莓渣發(fā)酵乳飲料的生產(chǎn)工藝，結(jié)果表明：脫脂奶粉添加量20%、食用葡萄糖添加量12%、藍(lán)莓渣添加量0.4%、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h和接種量0.5%等條件下得到的藍(lán)莓渣發(fā)酵乳飲料其保加利亞乳桿菌菌落數(shù)最高，產(chǎn)品中花青素含量最高，而且風(fēng)味獨(dú)特，口感適宜，是一種值得開發(fā)、極具市場(chǎng)價(jià)值的保健發(fā)酵乳飲料。