牦牛MT—3基因生物信息學分析

李潔 王建福

摘要：利用生物基因組學數(shù)據(jù)庫，對牦牛金屬硫蛋白3基因進行生物信息學分析，從而預測 MT-3 基因編碼產物的理化性質以及功能結構域，并構建MT-3同源基因的系統(tǒng)進化樹。結果表明，牦牛MT-3 基因含有1 個 513 bp 的ORF，編碼 170 個氨基酸。MT-3蛋白分子質量約為17 556.37 Da，理論等電點為 5.68。MT-3 編碼產物的二級結構主要以β折疊和無規(guī)則卷曲為主，推測是非酶類蛋白質。MT-3具有神經(jīng)生長抑制活性，通過清除自由基和 NO ，從而起到保護腦細胞的作用。

關鍵詞：牦牛；金屬硫蛋白3基因；生物信息學分析

中圖分類號：S826；Q57 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）02-0058-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.02.016

Bioinformatics Analysis of Wild Yak MT-3 Gene

LI Jie， WANG Jianfu

（College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：This study aimed to study the bio-information of Wild yak MT-3 gene. The physicochemical characteristics， structures and functions of ovine MT-3 are predicted with software tools and database. Meanwhile， the phylogenetic tree of MT-3 and related proteins is constructed， The results show that the ORF of MT-3 is 513 bp which encoded 170 amino acids. The Wild yak protein of MT-3 is 17 556.37 Da in molecular weight， isoelectric point is 5.68. The secondary structure of MT-3 shows that it is mainly constituted of β-pleated sheet and coils， the encoding production conjecturally belongs to non-enzyme protein. MT-3 has an inhibitory activity on nerve growth， by scavenging free radicals and NO， it plays a role in protecting brain cells.

Key words：Wild yak；Metallothionein 3 gene；Bioinformatics analysis

收稿日期：2017 - 09 - 28

基金項目：甘肅省農牧廳生物技術子課題（GNSW-2011-27）。

作者簡介：李 潔（1982 — ），女，河南商丘人，實驗師，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。

通信作者：王建福（1982 — ）男，河南商丘人，講師，主要從事水產養(yǎng)殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。

定西市安定區(qū)位于甘肅省中部，北緯35° 17′54″至36° 02′ 40″，東經(jīng)104° 12′ 48″至105° 01′06″，南北長82.9 km，東西寬73.3 km，海拔 1 700～2 580 m，屬典型的黃土高原干旱半干旱雨養(yǎng)農業(yè)區(qū)，抗旱生產是安定區(qū)農業(yè)工作的重點。中晚熟玉米適宜海拔在2 000 m以下的區(qū)域種 植[1 ]，而安定區(qū)大面積耕地海拔在2 000 m以上，中晚熟品種很難成熟，全膜雙壟溝播技術將玉米種植范圍擴大到海拔2 100 m區(qū)域[2 - 3 ]。為了考察早熟玉米新品種在安定區(qū)高海拔區(qū)的適應性、抗逆性、生產穩(wěn)定性，2017年安定區(qū)農業(yè)技術推廣服務中心引進了7個早熟玉米新品種進行比較試驗，以期篩選出適合當?shù)睾０? 100 m以上區(qū)域生產應用的玉米品種?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試玉米品種7個，其中武科早303、武科早304由武威市武科種業(yè)科技有限公司生產，甘玉804由甘肅種業(yè)有限責任公司生產，興達1601、興達1602由甘肅興達種業(yè)有限公司生產，金穗606、金穗607及當?shù)爻Ｒ?guī)種植品種金穗3號（CK）由白銀金穗種業(yè)有限公司生產。

1.2 試驗地概況

試驗設在定西市安定區(qū)團結鎮(zhèn)小山村，海拔 2 150 m，年平均降水量430 mm，年蒸發(fā)量1 450 mm，無霜期141 d。前茬作物收獲后深耕曬垡，冬前淺耕耙耱。采用全膜雙壟溝播技術[4 ]，大壟寬70 cm、高10 cm，小壟寬40 cm、高15 cm。覆膜前結合整地一次性基施農家肥45 000 kg/hm2、玉米專用肥（N-P2O5-K2O為20-15-15）1 200 kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5 kg/hm2加適量水噴拌細土450 kg制成毒土，撒施地面后起壟覆膜以防治地下害蟲。用50%乙草胺乳油3 750 mL/hm2兌水600 kg噴灑于壟溝表面芽前除草。

1.3 試驗方法

試驗為隨機區(qū)組設計，每品種為1個處理，3次重復，小區(qū)面積39.6 m2（11.0 m×3.6 m）。4月19日用玉米點播器播種，每穴2粒，播深4 cm，行距55 cm，株距30 cm，密度為60 000株/hm2。田間管理措施同當?shù)卮筇?。田間觀察記載物候期及主要農藝性狀，成熟后按小區(qū)抽樣考種并單收計產。

2 結果與分析

2.1 生育期

從表1可以看出，各品種出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬開始拔節(jié)，與金穗3號（CK）基本一致；興達1601、金穗606、興達1602拔節(jié)期較金穗3號（CK）遲13～16 d。抽雄期武科早303、武科早304均為 7月11日，較金穗3號（CK）早4 d；興達1602與金穗3號（CK）一致；金穗606、興達1601、甘玉804較金穗3號（CK）晚2 d。成熟期武科早303、武科早304、興達1602最早，8月下旬已經(jīng)成熟，較金穗3號（CK）早9 d；金穗607、甘玉804、興達1601、金穗606均在9月上旬與金穗3號（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、興達1602均為117 d，較金穗3號（CK）短9 d；其他品種生育期為126 d，與金穗3號（CK）相同。

2 主要性狀

由表2可見，株高以金穗607、甘玉804、興達1601最高，均為 2.5 m，較金穗3號（CK）高出0.5 m；武科早304、金穗606次之，均為2.4 m，較金穗3號（CK）高出0.4 m；武科早303、興達1602最低，為1.7 m，較金穗3號（CK）低0.3 cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，為80.0 cm，較金穗3號（CK）高12.5 cm；金穗607次之，為73.0 cm，較金穗3號（CK）高5.5 cm；武科早303最低，為36.5 cm，較金穗3號（CK）低31.0 cm。穗長以興達1601最長，為23.0 cm，較金穗3號（CK）長5.0 cm；其次為甘玉804，為21.5 cm，較金穗3號（CK）長3.5 cm；武科早304最短，為17.5 cm，較金穗3號（CK）短0.5 cm；其他品種較金穗3號（CK）長0.5～2.0 cm。穗粗以金穗606最粗，為15.6 cm，較金穗3號（CK）粗0.1 cm，其他品種較金穗3號（CK）細0.2～2.3 cm。軸粗以武科早304最粗，為10.8 cm，較金穗3號（CK）粗0.8 cm；其次是金穗606，為10.3 cm，較金穗3號（CK）粗0.3 cm；其他品種較金穗3號（CK）細0.3～0.7 cm。粒型武科早304、興達1602與金穗3號（CK）一致，均為半馬齒型，其余品種均為馬齒型。粒色除武科早303、武科早304為黃紅色外，其余品種均與金穗3號（CK）一致，為黃色。軸色金穗607、甘玉804、興達1602為淺粉色；武科早303、興達1601、金穗606和金穗3號（CK）均為棕紅色；武科早304為白色。

2.3 產量及構成因子

由表3可知，穗粒數(shù)金穗607最多，為630粒，較金穗3號（CK）多132粒；其次是甘玉804，為552粒，較金穗3號（CK）多54粒；其余品種均較金穗3號（CK）少。百粒重以金穗606最高，為31.6 g，較金穗3號（CK）高8.2 g；其次是武科早303，為28.4 g，較金穗3號（CK）高5.0 g；武科早304、興達1601分別為27.7、24.5 g，較金穗3號（CK）分別高4.3、1.1 g；其余品種均低于金穗3號（CK）。折合產量以武科早304最高，為8 737.4 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產1 186.9 kg/hm2，增產率為15.7%；其次是武科早303，為8 611.1 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產1 060.6 kg/hm2，增產率14.0%；金穗607居第3位，折合產量8 585.9 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產13.7%；金穗606為8 484.9 kg/hm2，較金穗3號（CK）增產12.4%。對產量進行新復極差比較，各品種間產量差異均達到極顯著水平。

3 小結

在安定區(qū)海拔2 150 m的旱區(qū)，對引進的7個玉米品種進行了引種試驗。結果表明，參試各玉米品種均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4個品種綜合性狀優(yōu)良。其中武科早304折合產量最高，為8 737.4 kg/hm2，較對照品種金穗3號增產1 186.9 kg/hm2，增產率為15.7%；武科早303折合產量8 611.1 kg/hm2，較對照品種金穗3號增產1 060.6 kg/hm2，增產率14.0%；金穗607折合產量8 585.9 kg/hm2，較對照品種金穗3號增產13.7%；金穗606較對照品種金穗3號增產12.4%。

張雷等人[5 ]認為全膜雙壟溝播栽培玉米可在海拔2300 m以內的區(qū)域內種植。本試驗通過對供試玉米品種的性狀、生育期及產量結果進行綜合分析，建議在安定區(qū)海拔2 100～2 300 m區(qū)域擴大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的種植面積，其他品種可在海拔2 100 m以下區(qū)域進一步試驗。

參考文獻：

[1] 劉廣才，楊祁峰，李來祥，等. 旱地玉米全膜雙壟溝播技術增產效果研究[J]. 農業(yè)現(xiàn)代化研究，2009，30（6）：739-743.

[2] 牛建彪. 半干旱區(qū)小麥玉米雨水高效利用技術模式[J]. 甘肅農業(yè)科技，2005（5）：22-23.

[3] 楊祁峰，岳 云，熊春蓉，等. 不同覆膜方式對隴東旱塬玉米土壤濕度的影響[J]. 干旱地區(qū)農業(yè)研究，2009，27（1）：114-118.

[4] 王承義，李繼明. 不同地膜與覆膜期對全膜雙壟溝播玉米的影響[J]. 甘肅農業(yè)科技，2016（7）：54-56.

[5] 張 雷，牛建彪，趙 凡，等. 旱作玉米提高降水利用率的覆膜模式研究[J]. 干旱地區(qū)農業(yè)研究，2006，

24（2）：8-11.

（本文責編：陳 偉）

MT-3是一種金屬硫蛋白，又稱神經(jīng)生長抑制因子，其廣泛存在于哺乳動物的各種組織中，但主要表達于腦組織，在神經(jīng)膠質細胞和雄性生殖系統(tǒng)中也有表達[1 ]。MT-3的N端高度保守，而C端的氨基酸則相對變化較大[2 ]。據(jù)報道，表達MT-3的細胞保護DNA免受ROS破壞的能力更強，能更有效的保護單鏈DNA免受羥自由基的破壞[3 ]。在γ射線引起的氧化應激時，MT-3抑制了8-羥基鳥苷在細胞中的積累和基因突變，表現(xiàn)出抗癌和神經(jīng)保護的作用[4 - 5 ]。在含有MT-3 的神經(jīng)元中能夠調節(jié)兒茶酚胺能 、谷氨酸能及γ-氨基丁酸（GABA）能的神經(jīng)轉換。研究表明，MT-3 可拮抗谷氨酸（Glu）對神經(jīng)元的毒性，通過清除生成的 NO，從而起到神經(jīng)保護作用[6 ]。目前，MT-3基因的序列在豬、綿羊、山羊、牦牛、獼猴、家鼠、雞、牛、人等動物中均已公布，但其蛋白質結構和生物學功能還有待進一步研究。我們以從生物基因組數(shù)據(jù)庫調取了牦牛MT-3基因的序列為基礎，利用生物信息學相關軟件和網(wǎng)頁對牦牛 MT-3 基因及其編碼產物的理化性質、亞細胞定位、蛋白質結構和生物學功能進行預測和分析，以期為深入研究MT-3基因及其編碼蛋白的基本結構和生物學功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 序列來源

數(shù)據(jù)資料來源于NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫MT-3基因的參考序列登錄號[7 ]，包括牦牛（XM_014 479472.1）、人（NM_005954.3）、家鼠（NM_013603.2）、豬（NM_214056.1）、牛（NM_001113304.2）、綿羊（NM_001009755.1）、雞（NM_001097538.1）、獼猴（XM_001266138.1）8個物種的mRNA序列。

1.2 方法

牦牛MT-3基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）利用NCBI網(wǎng)頁中的ORF Finder程序對其mRNA序列進行識別預測分析。MT-3 基因編碼產物的理化性質采用 Bioedit 及 DNAStar 分析軟件預測。亞細胞定位采用 PSORTⅡ預測[8 ]。功能域及功能分類采用 Prot Fun 預測[9 - 10 ]?？缒^(qū)域的預測采用TMHMM 程序。二級結構采用 Jpred 分析預測。多序列比對及同源性分析采用 DNAMAN 軟件分析。

2 結果與分析

2.1 牦牛MT-3基因的ORF分析

利用NCBI網(wǎng)頁中的ORF Finder程序對牦牛MT-3基因的mRNA序列進行預測分析的結果見圖1。從圖1可以看出，牦牛MT-3基因序列中最大的開放閱讀框長度為513 bp，起始密碼子位于 55 bp 處，終止密碼子位于 567 bp 處，分析有170 個氨基酸殘基構成該編碼產物。

2.2 牦牛MT-3基因編碼產物序列同源性分析

利用DNAMAN軟件對牦牛MT-3基因編碼產物序列同源性進行分析的結果見圖2。從圖2可以看出，MT-3在很多物種中均有表達，尤其與牛、綿羊MT-3氨基酸序列同源性較高，推測與牛、綿羊這2個物種在進化過程中的親緣關系較近。從牦牛MT-3基因編碼產物的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看出，牦牛、牛系統(tǒng)發(fā)育距離最近與牛的親緣相似性高達99%。

2.3 牦牛MT-3基因編碼產物的理化性質分析

氨基酸是蛋白質的基本組成單位，蛋白質的基本性質包括其相對分子質量、氨基酸組成和等電點等[11 - 12 ]。采用 Bioedit 及 DNAStar 分析軟件預測牦牛MT-3基因編碼產物的氨基酸組成的結果（圖4）表明， MT-3基因編碼 170個氨基酸，組成最多的氨基酸是 Cys（半胱氨酸），所占比例為 15.3%。其編碼產物的理論分子量約為17 556.37 Da，理論等電點為 5.68。

2.4 牦牛MT-3基因編碼產物的亞細胞定位分析

從牦牛MT-3基因編碼產物的亞細胞定位結果（表1）可知，其分布在細胞核中的可能性為69.6%，分布在細胞質的可能性為13.0%，分布在線粒體的可能性為 4.3%，分布在細胞骨架的可能性為 12.9%。由此推斷，牦牛MT-3編碼產物主要在細胞核中發(fā)揮生物學作用。

2.5 牦牛MT-3基因編碼產物結構功能預測與分析

牦牛MT-3基因編碼產物結構功能分析采用ProtFun分析軟件進行預測，其結構域是二級蛋白序列片段經(jīng)過盤曲折疊形成的超二級結構，不同的結構域具有不同的特定的功能作用[12 ]。從表2可知，MT-3主要具有調控功能、轉錄和復制、翻譯和輔酶因子的生物合成的功能，可能性分別為0.265%、0.194%、0.105%和0.051%。由此推斷該蛋白具有調控功能的可能性最高，另外該蛋白在翻譯、轉錄和復制中發(fā)揮著重要調節(jié)作用。

2.6 牦牛MT-3基因編碼產物信號肽預測與分析

信號肽序列存在于分泌蛋白基因編碼序列中，位于起始密碼子之后的一段富含疏水氨基酸多肽的序列。如圖5所示，預測牦牛MT-3基因編碼產物不存在信號肽，無跨膜區(qū)，為非分泌性蛋白。

2.7 牦牛MT-3基因編碼產物二級結構的預測與分析

對牦牛MT-3氨基酸序列進行二級結構預測采用在線預測工具 Jpred分析的結果（圖 6 ）所知，牦牛MT-3 編碼產物從 N 端的第 13個氨基酸才開始出現(xiàn)二級結構，前12個氨基酸均沒有形成二級結構。MT-3蛋白二級結構主要由5個β折疊和多個無規(guī)則卷曲組成，沒有α螺旋。

3 結論

研究結果表明，牦牛MT-3 基因 ORF 長度為 513 bp，編碼170個氨基酸殘基；組成最多的氨基酸是 Cys（半胱氨酸），所占比例為 15.3%，其理論分子量約為 17 556.37 Da， 理論等電點為5.68。MT-3在很多物種中都有表達，其中與綿羊、牛MT-3編碼的氨基酸序列同源性一致，在系統(tǒng)發(fā)育樹中的距離最近。MT-3 編碼產物的二級結構主要以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。MT -3 除具有神經(jīng)生長抑制活性外，還可通過清除自由基和 NO ，從而起到神經(jīng)保護作用。

參考文獻：

[1] I ELGHAZI， B L MARTIN，I M ARMITAGE. Metallothionein-3 is a component of muti protein complex in the mouse brain[J]. Exp. Biol. Med.，2006，231：1500-1506.

[2] 張容昶. 中國的牦牛[M]. 蘭州：甘肅科學技術出版社，1988：42-43.

[3] ISHIHARA K， HIRANO T. IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease[J]. Cytokine Growth Factor. Rev.， 2002， 13 ：357-368.

[4] GHAZI I E I， MARTIN B L， ARMITAGE I M . Metallothionein-3 is a component of a muti protein complex in the mouse brain[J]. Exp. Biol. Med.，2006，231：1500-1506.

[5] MILES A T， H AWKSWORTH G M ， BEATTIE J H，et al. Induction，regulation，degradation， and biological significance of mammalian metallothioneins[J]. Crit. Rev. Bioehem. Mol. Biol.，2000，35：35-70.

[6] MONTOLIU C，MONFORT P，CARRASCO J，et al. Metallothionein-Ⅲ prevents glutamate and nitric oxide neurotoxicity in primary cultures of cerebellar neurons[J]. Journal of Neurochemistry，2000，75（2）：266-273.

[7] 張小雪，潘香羽，李發(fā)弟，等. 綿羊ESR 基因生物信息學分析[J]. 甘肅農業(yè)科技，2014（9）：30-33.

[8]GONZALO D H， LAI K K， SHADRACH B，et al.Gene expression profiling of serrated polyps identifies annex in A10 as a marker of a sessile serrated adenoma/polyp[J]. J. Pathol.，2013，230：420-429.

[9] RAYNALP，POLLARD H B. Annexins：the problem of assessing the biological role for a gene family of multi-functional calcium and phospholipid-binding proteins[J]. Biochim Biophys Acta，1994，1197：63-93.

[10] GERKEV，MOSS S E. Annexins：from structure to function[J]. Physiol. Rev.，2002，82：331-371.

[11] 張小雪，潘香羽，李發(fā)弟，等. 綿羊GDF9基因生物信息學分析[J]. 甘肅農業(yè)科技，2014（8）：18-21.

[12] 隋景巍. 綿羊PTGER3基因生物信息學分析[J]. 鄉(xiāng)村科技，2017（4）：52-55.

（本文責編：楊 杰）