青風(fēng)藤正丁醇萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖影響的研究

雷欣睿 朱欣婷 劉云 葉萌 王文洪 李曉飛

摘 要：為驗(yàn)證青風(fēng)藤正丁醇萃取物（BESA）體外抗肝癌活性，研究了BESA對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721形態(tài)變化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示BESA對(duì)HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞均有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為 18.23 μg/mL，23.45 μg/mL，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系；經(jīng)BESA處理后，HepG2細(xì)胞形態(tài)變化很大，細(xì)胞出現(xiàn)核皺縮、貼壁性差、細(xì)胞裂解等現(xiàn)象，以20 μg/mL的BESA處理HepG2細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到BESA對(duì)HepG2細(xì)胞周期的干預(yù)能力不強(qiáng)；但在誘發(fā)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡方面效果明顯，說明BESA能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

關(guān)鍵詞：青風(fēng)藤；人肝癌細(xì)胞HepG2；人肝癌細(xì)胞SMMC-7721；抑制作用

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

青風(fēng)藤（Sinomenium acutum），又名清風(fēng)藤、扶風(fēng)藤、尋風(fēng)藤，為防己科植物青藤sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.和毛青藤sinomenium scutum（Thunb.）Rehd.etWils.var.cinereum Rehd.et Wils.的干燥藤莖[1]。青風(fēng)藤味苦性平，有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利水止痛的功效，用于治療風(fēng)濕麻痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、瘙癢、水腫、腳氣等[2]。目前，對(duì)青風(fēng)藤的研究集中于化學(xué)成分的分析及藥理活性的研究[3]。青風(fēng)藤的莖和根中富含的青藤堿是研究者重點(diǎn)研究的活性成分[4]，在降血壓[5]、抗炎[6]、免疫抑制[7]、鎮(zhèn)痛[8]等方面青藤堿具有良好的藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤乙醇提取物具有良好的體外抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的活性；調(diào)研更多的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤的主要成分——青藤堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞[9]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞[10]、腎癌細(xì)胞[11]、乳腺癌細(xì)胞[12]等腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。眾所周知，中藥是一個(gè)成分極其復(fù)雜的體系，所含的某些微量成分往往具有很強(qiáng)的生理活性；因此課題組擬開展青風(fēng)藤可能含有的微量抗癌新化合物的挖掘工作。在接下來的研究工作中，課題組首先采用了極性由小至大的溶劑萃取策略。即利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)青風(fēng)藤乙醇提取物依次萃取。再對(duì)各個(gè)萃取部位抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤正丁醇萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效果明顯好于其他極性部位。因此，在本文中課題組將重點(diǎn)從細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡四個(gè)方面對(duì)青風(fēng)藤正丁醇萃取物的體外抗癌效應(yīng)做出評(píng)價(jià)，為青風(fēng)藤中微量抗癌新化合物的深度挖掘做前期準(zhǔn)備工作。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；青風(fēng)藤產(chǎn)地為四川，由醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心宋長(zhǎng)偉博士鑒定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清（以色列BI公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素（美國(guó) Gibco 公司）；DMSO、胰蛋白酶、Tris（北京索萊寶科技有限公司）；磺酰羅丹明B（美國(guó) Sigma 公司）；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、DNA含量（細(xì)胞周期）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。96 孔板、6孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶（美國(guó)康寧公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SENCOR-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海中順生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)賀利氏公司），UR-4100型酶標(biāo)儀（上海拜格生物科技發(fā)展有限公司），GTR21-1高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司產(chǎn)品）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青風(fēng)藤正丁醇萃取物的制備

青風(fēng)藤全株風(fēng)干、粉碎、過60目篩。稱取粉末 100 g加1 L 95%乙醇，3 h回流提取兩次，合并兩次抽濾的提取液，減壓濃縮去除溶劑。干燥后至恒重得青風(fēng)藤醇提物，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇洗脫，收集各段洗脫液，濃縮。用SRB法對(duì)各萃取部位進(jìn)行抗腫瘤活性的粗篩，發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤正丁醇萃取物對(duì)肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制活性，故選取青風(fēng)藤正丁醇萃取物（以下簡(jiǎn)稱BESA）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。稱取正丁醇提取物10 mg，100 μL DMSO 溶解后，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，室溫保存。

1.2.2 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮中取出凍存HepG2細(xì)胞的凍存管， 37 ℃的雙蒸水快速解凍，然后取出置于含10%胎牛血清（內(nèi)含青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL）的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3傳代培養(yǎng)，每日更換新鮮培養(yǎng)基。SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)方法同上。

1.2.3 SRB法測(cè)定BESA對(duì)肝腫瘤細(xì)胞增殖的影響

取HepG2（或SMMC-7721）細(xì)胞，以200 μL 8000個(gè)/孔接種于96孔板中，每種細(xì)胞接種一塊實(shí)驗(yàn)板（T）和一塊對(duì)照板（T0）。培養(yǎng) 20 h 后，對(duì)照板每孔加入50 μL 4 ℃預(yù)冷的三氯乙酸（TCA）溶液；實(shí)驗(yàn)板換入200 μL 含BESA的培養(yǎng)基使其終濃度分別為 1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL，每種濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，另設(shè)置陰性對(duì)照組（C）和溶劑對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h加入50 μL 4℃預(yù)冷的TCA溶液，靜置5 min移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出用雙蒸水沖洗5遍，室溫晾干。每孔加入70 μL 0.4%的SRB染液，10 min后用1%醋酸沖洗5次，晾干后加入100 μL 10 mmol/L的緩沖Tris堿液溶解，在酶標(biāo)儀上采用波長(zhǎng)530 nm測(cè)吸光度值。按照下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。改良寇氏法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），公式為

1.2.4 BESA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

將約長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以1×104個(gè)/孔接種到24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，24 h后，棄培養(yǎng)液。每孔分別加入含一定體積BESA的細(xì)胞培養(yǎng)基使其藥物處理濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL，空白對(duì)照組加入對(duì)應(yīng)體積的DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后于倒置顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)的變化情況并拍照。

1.2.5 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

取HepG2細(xì)胞以2×104 個(gè)/瓶接種到六孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含一定體積的BESA的細(xì)胞培養(yǎng)基使其藥物處理終濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL，空白對(duì)照組加入對(duì)應(yīng)體積的DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后收集所有細(xì)胞，按照碧云天細(xì)胞周期或細(xì)胞凋亡試劑盒的使用說明進(jìn)行待測(cè)樣品的制備，最后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BESA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

BESA對(duì)肝癌SMMC-7721、HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用如表 1 所示。BESA濃度分別為1.25、 2.5 μg/mL時(shí)，對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率較低；隨著濃度的升高，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)BESA濃度為40 μg/mL時(shí)，對(duì)SMMC-7721、HepG-2的抑制率分別為60.32%、58.59%。經(jīng)改良寇氏法計(jì)算其IC50分別為18.23、23.45 μg/mL。

2.2 BESA對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響

由表1可知，本實(shí)驗(yàn)中BESA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制效果較好，因此選取肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)考察BESA對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的作用。如圖1所示，空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)正常，接近于長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿；終濃度為10 μg/mL的BESA作用48 h后，細(xì)胞變圓且突起，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞與鄰近細(xì)胞分離，貼壁能力下降，形態(tài)異常的細(xì)胞增多。當(dāng)作用濃度提高到20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞密度顯著減小，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮的現(xiàn)象，顯示出很強(qiáng)的抑制作用。

2.3 BESA對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響

終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的BESA作用于HepG2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)其細(xì)胞周期變化，結(jié)果見表2。給藥后G0/G1期細(xì)胞數(shù)下降，S期的細(xì)胞數(shù)增加，G2/M期細(xì)胞數(shù)也略有增加，綜合來看BESA對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響不大。

2.4 BESA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

終濃度為5、10、20 μg/mL（IC50）的BESA作用于肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)其細(xì)胞凋亡的變化情況，結(jié)果如圖2所示：與未給藥的對(duì)照組比較，BESA能誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，凋亡現(xiàn)象明顯；且誘發(fā)凋亡的程度與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第三位[13]。青風(fēng)藤原本是一味用于治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)民間中藥，但現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其主要成分——青藤堿具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生理活性[14-15]。由于中藥是一個(gè)多成分多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，某些未知微量成分往往具有更強(qiáng)的生理活性[16-17]；課題組認(rèn)為青風(fēng)藤中極有可能含有活性更強(qiáng)的新化合物，開展青風(fēng)藤微量抗癌新化合物的挖掘工作非常有意義。

實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的前提是從多個(gè)角度確認(rèn)青風(fēng)藤活性部位是否具有明確的抑癌效應(yīng)。在前期的研究中，課題組采用SRB法對(duì)其抗腫瘤活性的有效部位進(jìn)行了初篩，發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤乙醇提取物的正丁醇萃取部分對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)首先以人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)BESA對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721的抑制作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其IC50分別為18.23 μg/mL和23.45 μg/mL。由IC50可知，BESA對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的抑制作用較強(qiáng)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中又以HepG2細(xì)胞為重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BESA作用后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮、細(xì)胞貼壁性差、細(xì)胞裂解等現(xiàn)象。

由于腫瘤的發(fā)生常與細(xì)胞的異常增殖有密切的關(guān)系，腫瘤細(xì)胞的周期阻滯劑可能成為抑制癌癥的有效物質(zhì)[18]；青風(fēng)藤中是否含有此類造成細(xì)胞周期阻滯的物質(zhì)呢？為了回答這個(gè)問題，本研究考察了BESA對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BESA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞周期干預(yù)的能力較弱。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了BESA誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示20 μg/mL濃度的BESA就能造成10%以上的HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，BESA誘發(fā)細(xì)胞凋亡的能力非常強(qiáng)；提示：BESA中含有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的物質(zhì)，值得進(jìn)一步深度挖掘。基于本文的研究結(jié)果，在后續(xù)研究中課題組將利用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)青風(fēng)藤正丁醇萃取物中所含有的微量成分進(jìn)行分離純化，再輔以現(xiàn)代波譜分析技術(shù)進(jìn)一步確定活性化合物的結(jié)構(gòu)，為合理利用青風(fēng)藤這一傳統(tǒng)中藥材，以及后期的新藥創(chuàng)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：江 龍）