農(nóng)桿菌介導(dǎo)EuABP2基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲下胚軸研究

周舒婷 董旋 趙懿琛 趙德剛

摘 要：為提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化效率，本研究以杜仲種子為材料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了NAA濃度、種子切割方式及光照強(qiáng)度對(duì)杜仲萌發(fā)及下胚軸直徑和長(zhǎng)度的影響；獲得篩選標(biāo)記草銨膦用于杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的適宜濃度，并對(duì)杜仲抗性芽生根方式進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：NAA （0.5 mg/L） ，正中橫切，暗培養(yǎng)15 d，能有效的促進(jìn)杜仲種子萌發(fā)及下胚軸的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)條件下杜仲種子萌發(fā)率可達(dá)95%，下胚軸直徑1.21 mm，長(zhǎng)度22.5 mm；以0.25 mg/L的草銨膦能夠?qū)Χ胖俎D(zhuǎn)基因抗性芽進(jìn)行有效篩選；成功獲得轉(zhuǎn)EuABP2基因表達(dá)的杜仲轉(zhuǎn)基因植株12株。

關(guān)鍵詞：杜仲；EuABP2基因；遺傳轉(zhuǎn)化；下胚軸

中圖分類號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）03-0033-07 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.006

Genetic Transformation of EuABP2 Gene into the Hypocotyl of Eucommia Ulmoides Oliv. [Garryales： Eucommiaceae] via Agrobacterium-mediated Method

ZHOU Shuting1， DONG Xuan1， 2，ZHAO Yichen1， 2*， ZHAO Degang1， 3

（1.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/ Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering， Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China； 2.The 2011 Collaboration Innovation Center for Mountain Ecology and Agro-Bioengineering in Guizhou Province， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China；3.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China）

Abstract：To improve the efficiency of genetic transformation of Eucommia ulmoides hypocotyl via Agrobacterium-mediated method， we used Eucommia ulmoides seed as the research material to systematically investigate the influence of NAA concentration， seed cutting mode and light intensity on germination and hypocotyl diameter and length. Appropriate concentration of glufosinate for the genetic transformation of Eucommia ulmoides was obtained. Rooting method of Eucommia ulmoides resistant roots was optimized. The results showed that NAA （0.5 mg/L）， mid cut and dark culture for 15 days could effectively promote the germination and hypocotyl growth of Eucommia ulmoides seed. Under these conditions， the seed germination rate was up to 95%， the diameter of hypocotyl reached 1.21 mm and its length was up to 2.25 cm. Glufosinate at 0.25 mg/L could effectively screen the transgenic resistant buds of Eucommia ulmoides. In addition， by keeping partial hypocotyl and promoting rooting， Twelve EuABP2 gene-expressed Eucommia ulmoides plants were successfully obtained.

Key words：Eucommia ulmoides olive； EuABP2 gene； genetic transformation； hypocotyl

杜仲 （Eucommia ulmoides Oliv.） 又名膠木[1]，為杜仲科杜仲屬落葉喬木，原產(chǎn)于中國(guó)，為我國(guó)特有的第三紀(jì)孑遺植物種[2]，杜仲不僅是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名貴中藥材[3]，也是重要的含膠植物，在中國(guó)的分布以秦嶺以南各省為主，主要分布于云南、貴州等地[4]。近年來(lái)對(duì)杜仲的研究主要集中在化學(xué)成分分離，而分子生物學(xué)研究尤其是功能基因的分離與應(yīng)用報(bào)道較少。研究植物功能基因的重要途徑是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行功能驗(yàn)證。研究表明，木本植物轉(zhuǎn)基因研究的最佳外植體應(yīng)是下胚軸[5-6]。作為木本植物之一的杜仲，種子發(fā)芽率不高，獲得優(yōu)良下胚軸往往比較困難[7]。已有研究報(bào)道種子的萌發(fā)及下胚軸生長(zhǎng)與生長(zhǎng)素濃度[8-9]、種子切口方式[10-11]及光照條件[12]有關(guān)。目前，已有一些對(duì)杜仲再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究報(bào)道，左春芬等人[13]最早涉及這方面的研究，他們用杜仲幼嫩樹枝為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，但未能獲得再生植株。1994年，夏啟中、宋太偉等[14]以杜仲實(shí)生苗莖尖為外植體，獲得了完整的再生植株。朱登云等[15]以杜仲成熟干胚乳、葉片、葉柄誘導(dǎo)愈傷組織并再生植株，誘導(dǎo)效率在13%以上；王東良等[16]以1/3MS附加0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)生根，生根率為18%；李巖等[17]在含有0.1 mg/L NAA+0.8 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)杜仲胚軸產(chǎn)生不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)到47%，趙丹等[18]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以杜仲下胚軸為轉(zhuǎn)化受體對(duì)杜仲進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，研究了卡那霉素濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度及侵染時(shí)間、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，成功獲得了轉(zhuǎn)基因杜仲植株，陽(yáng)性植株獲得率可達(dá)45%；Chen等[19]對(duì)杜仲無(wú)菌苗進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以杜仲下胚軸為轉(zhuǎn)化受體，超聲處理后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)杜仲進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并改進(jìn)了培養(yǎng)基配方。

為了建立一種杜仲遺傳轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)的外源基因?qū)氲倪z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)[20-22]，用于目標(biāo)基因的功能驗(yàn)證和基因工程改良杜仲，本研究以培育優(yōu)良杜仲下胚軸為目標(biāo)，通過(guò)分析NAA濃度、種子切口方式及光照強(qiáng)度對(duì)萌發(fā)杜仲下胚軸及下胚軸直徑和長(zhǎng)度的影響，以便優(yōu)化和確定獲得優(yōu)良杜仲下胚軸萌發(fā)及生長(zhǎng)的最適條件，并構(gòu)建了Act1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)杜仲EuABP2表達(dá)的植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化杜仲下胚軸，以草銨膦濃度進(jìn)行篩選，確定優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化條件，為杜仲遺傳改良及杜仲基因的功能鑒定奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所用杜仲種子取自貴州大學(xué)轉(zhuǎn)基因植物試驗(yàn)示范基地杜仲植株。質(zhì)粒載體、菌株和PCR檢測(cè)引物均由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存。遺傳轉(zhuǎn)化所用根癌農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404，構(gòu)建的pGM626-Act1-EuABP2載體包含由UBi啟動(dòng)的Bar：：GUS篩選標(biāo)記以及由Act1啟動(dòng)的EuABP2，目的基因由NOS終止 （圖1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工程菌制備及PCR檢測(cè)

將含有表達(dá)載體pGM626-Act1-EuABP2的質(zhì)粒通過(guò)凍融法[23]轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株LBA4404以制備工程菌株。取-80℃保存的LBA4404感受態(tài)細(xì)胞置于冰中解凍10 min；向每支感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μL質(zhì)粒DNA，輕輕彈動(dòng)混勻后冰浴30 min；液氮速凍5 min后，立即37℃水浴2 min；加入900 μL 37℃預(yù)熱YEP液體培養(yǎng)基，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)3 h；室溫，4000×g離心1 min后，棄上清；向菌體中加入100 μL YEP液體培養(yǎng)基，用槍頭吸打使之混勻；取適量菌液涂布于含有100 mg/L Kan和20 mg/L Rif的YEP平板培養(yǎng)基上，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，-80℃保存菌液。

1.2.2 杜仲種子萌發(fā)及下胚軸生長(zhǎng)條件的篩選

1.2.2.1 杜仲種子消毒

收集成熟的杜仲種子；剝掉種子外殼，用清水浸泡12 h；用含表面活性劑的洗手液清洗種子并以自來(lái)水沖洗30 min，直至洗手液完全沖洗干凈；超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水漂洗1～ 2次后用有效氯為10%的NaClO溶液浸泡20 min，期間用鑷子輕輕攪動(dòng)，無(wú)菌水漂洗4～5次。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用正交試驗(yàn)方法[24]，按SPSS 17.0 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，輸入多因素條件，以SPSS軟件分析，自動(dòng)生成正交試驗(yàn)組合（見(jiàn)表2）。采用的杜仲種子處理有切割方式 （不切割、單端切割、兩端切割和正中橫切），置不同濃度的NAA （0 mg/L、0.5 mg/L、5 mg/L、50 mg/L） MS培養(yǎng)基、不同光照條件 （光培、暗培） ，杜仲種子處理后在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，觀察記錄不同處理杜仲種子發(fā)芽率和杜仲下胚軸的長(zhǎng)度及直徑。由于下胚軸的生長(zhǎng)狀況彎曲不定，測(cè)其長(zhǎng)度時(shí)，先用細(xì)繩隨下胚軸彎曲擺放來(lái)替代其生長(zhǎng)趨勢(shì)，然后再用直尺來(lái)測(cè)量細(xì)繩的拉直長(zhǎng)度，以此得到下胚軸的長(zhǎng)度。下胚軸的直徑取最大值與最小值的平均值，下胚軸的最大直徑和最小直徑直接用游標(biāo)卡尺來(lái)進(jìn)行精確測(cè)量。

1.2.3 外植體制備及預(yù)處理

將萌發(fā)15 d的杜仲幼苗從種子萌發(fā)培養(yǎng)基中取出，輕輕洗去附著在幼苗上的培養(yǎng)基，并將幼苗移入懸浮培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)3 d，然后置于無(wú)菌吸水紙上吸干培養(yǎng)液，將無(wú)菌苗切成5～8 mm小段，去除莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)部分。將切好的杜仲外植體放入重懸液中，超聲處理20 min后以備轉(zhuǎn)化。

1.2.4 草銨膦抗性濃度篩選

切取未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的杜仲15 d苗齡無(wú)菌苗下胚軸20個(gè)，分別接種于MS含0 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L Bar的篩選培養(yǎng)基上，30 d時(shí)觀察并統(tǒng)計(jì)下胚軸上生長(zhǎng)的不定芽數(shù)。

不定芽誘導(dǎo)率=（生長(zhǎng)出不定芽的下胚軸數(shù)÷接種的下胚軸數(shù)）×100%。

1.2.5 菌種活化及預(yù)處理

取-80℃保存的含有pGM626-Act1-EuABP2植物表達(dá)載體的LBA4404菌株，涂平板接種于含100 mg/L Kan 和20mg/L Rif的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃下倒置暗培2 d，待菌落長(zhǎng)出，挑取陽(yáng)性單菌落接種于5 mL含100 mg/L Kan 和20 mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃搖床上200 r/min振蕩活化培養(yǎng)16～20 h，取50～100 μL菌液接種于相同的YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，5000 g 4℃離心10 min，棄上清，用重懸液重懸菌體至OD600值為0.25～0.3，在菌體重懸液中加入10 μL表面活性劑備用。

1.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化

將超聲處理20 min后的杜仲外植體置于菌體重懸液中侵染，侵染時(shí)間3 min。取出侵染結(jié)束的杜仲外植體置于無(wú)菌紙上吸干菌液，緊密排布于共培培養(yǎng)基上，28℃暗培3 d后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每15 d換一次篩選培養(yǎng)基。將分化出抗性芽的杜仲外植體從中間部位切斷，保留部分下胚軸以促進(jìn)生根，將外植體上未產(chǎn)生不定芽的一段插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每15 d換一次生根培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性植株獲得率及不定芽的生根率。

陽(yáng)性植株獲得率=（陽(yáng)性植株數(shù)÷獲得的植株數(shù)）×100%。

生根率=（生根的不定芽數(shù)÷接種的不定芽數(shù)）×100%。

1.2.7 GUS基因組織染色的檢測(cè)

將篩選出杜仲抗性芽葉片置于GUS組織化學(xué)染色液中侵泡，抽真空10 min，37℃溫育6 h，然后使用75%和95%的乙醇脫色12 h，觀察、鏡檢并照相。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft office Excel 2003及SPSS 17軟件進(jìn)行處理和分析，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌的PCR鑒定

提取經(jīng)Kan篩選獲得的陽(yáng)性農(nóng)桿菌單菌落DNA，進(jìn)行PCR后電泳觀察，結(jié)果表明，所選擇的陽(yáng)性菌株中含有與目的基因大小一致的擴(kuò)增片段，可認(rèn)為質(zhì)粒pGM626-Act1-EuABP2已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化所選擇的陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株。

2.2 各因素對(duì)杜仲種子萌發(fā)及下胚軸生長(zhǎng)的影響

通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）的極差分析表明，NAA處理濃度的R值（極差，數(shù)值越大證明對(duì)結(jié)果影響越大）最大，為1.388，切割方式的R值最小，為0.228（表4），說(shuō)明NAA濃度對(duì)杜仲種子下胚軸長(zhǎng)度生長(zhǎng)影響最大，其次為光照條件，而切割方式影響最小。方差分析表明，NAA濃度和光照條件對(duì)杜仲種子下胚軸長(zhǎng)度的影響達(dá)顯著水平，而切割方式對(duì)其影響不顯著（表5）。

對(duì)各因素不同水平條件下的杜仲種子萌發(fā)率及幼苗生長(zhǎng)狀況研究表明，未經(jīng)切割的第3、8、12組的杜仲種子萌發(fā)率只有30%左右，分別為35%、30%和25%。第16組未經(jīng)切割但在濃度為0.50 mg/L的NAA促進(jìn)作用下，種子萌發(fā)率達(dá)到58%，而其余經(jīng)過(guò)切割的杜仲種子萌發(fā)率均高于不切割時(shí)種子的萌發(fā)率，正中橫切時(shí)種子萌發(fā)率最高可達(dá)95%，最低為60%；單端切割時(shí)種子萌發(fā)率最高可達(dá)95%，最低為52%；兩端切割時(shí)種子萌發(fā)率最高可達(dá)94%，最低為51%。NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，采用正中橫切，杜仲下胚軸長(zhǎng)度最大。不切割和正中切割，NAA濃度在0～0.5 mg/L之間時(shí)，下胚軸長(zhǎng)度隨NAA濃度增大而增大。采用單端切割或兩端切割，NAA對(duì)下胚軸生長(zhǎng)起抑制作用。在NAA濃度為5 mg/L時(shí)，不切割和兩端切割的處理中杜仲直徑最大。NAA濃度為0～5 mg/L時(shí)，對(duì)杜仲下胚軸徑粗生長(zhǎng)起促進(jìn)作用；NAA濃度大于5 mg/L則抑制徑粗生長(zhǎng)。本試驗(yàn)條件下，光照對(duì)根生長(zhǎng)的影響不顯著。因而，最適宜杜仲下胚軸生長(zhǎng)的條件為：NAA濃度0.5 mg/L ，正中橫切，暗培養(yǎng)15 d，種子萌發(fā)率達(dá)到95%，下胚軸直徑可達(dá)1.21 mm，長(zhǎng)度可達(dá)22.5 mm。

2.3 Bar最適宜抑制濃度篩選

對(duì)30 d后不同濃度Bar篩選培養(yǎng)基上接種的未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的杜仲15 d苗齡無(wú)菌苗下胚軸生長(zhǎng)狀況統(tǒng)計(jì)進(jìn)行，結(jié)果顯示：Bar濃度為0 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為83%；Bar濃度為0.25 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為37%；Bar濃度為0.50 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為12%；Bar濃度為1.00 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為0%。當(dāng)Bar濃度為0.25 mg/L時(shí)，杜仲無(wú)菌苗下胚軸不定芽誘導(dǎo)率為37%明顯受抑制，為平衡不定芽誘導(dǎo)率及篩選效率，選Bar濃度為0.25 mg/L為篩選濃度（表8）。在對(duì)篩選標(biāo)記草銨膦的篩選濃度進(jìn)行選擇時(shí)，本研究選擇了對(duì)杜仲分化有顯著抑制但又不完全抑制的濃度 （0.25 mg/L） ，濃度過(guò)高會(huì)造成杜仲不定芽誘導(dǎo)率極低，濃度過(guò)低則無(wú)法滿足篩選效率，當(dāng)篩選標(biāo)記草銨膦的篩選濃度為0.25 mg/L時(shí)，既能得到較高的杜仲不定芽誘導(dǎo)率，又能起到一定的篩選作用，而未被篩選掉的抗性芽會(huì)通過(guò)GUS組織染色進(jìn)一步篩選。

2.4 杜仲下胚軸轉(zhuǎn)化效率分析

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的方法遺傳轉(zhuǎn)化杜仲后得到14株杜仲轉(zhuǎn)基因植株，GUS組織染色初步檢測(cè)獲得12株陽(yáng)性植株，陽(yáng)性植株獲得率可達(dá)85.7%。通過(guò)采取保留部分下胚軸以促進(jìn)生根的方式成功誘導(dǎo)7株不定芽生根，生根率可達(dá)58.3%。杜仲下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程及GUS染色情況見(jiàn)圖4。

3 結(jié)論與討論

外源基因?qū)氲倪z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是目標(biāo)基因的功能驗(yàn)證和基因工程改良育種的重要步驟，由于木本植物和草本植物在生長(zhǎng)發(fā)育條件、器官部位等方面有相當(dāng)大的差異，尤其是木本植物中較多的多酚類物質(zhì)會(huì)阻礙細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，導(dǎo)致木本植物組織培養(yǎng)再生體系的建立十分困難，而杜仲作為一種木本植物其再生體系，以及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立一直以來(lái)都是研究的難點(diǎn)。在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)杜仲種子萌發(fā)率低，且不易獲得滿足遺傳轉(zhuǎn)化條件的下胚軸，而下胚軸萌發(fā)情況是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一。本研究通過(guò)對(duì)光照條件，生長(zhǎng)素濃度及種子切割方式的種子萌發(fā)條件的優(yōu)化，使杜仲種子萌發(fā)率達(dá)到95%，獲得大量適用于遺傳轉(zhuǎn)化的下胚軸，大大降低了杜仲遺傳轉(zhuǎn)化中的工作量。在以優(yōu)質(zhì)的杜仲下胚軸為遺傳轉(zhuǎn)化的材料，基于趙丹、Chen的研究結(jié)果進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性植株獲得率較本實(shí)驗(yàn)室前期顯著提高，由45%提高到85.7%。通過(guò)保留部分下胚軸以促進(jìn)生根的方式顯著提高了不定芽的存活率，成功誘導(dǎo)不定芽生根，生根率可達(dá)58.3%，本實(shí)驗(yàn)的研究工作為杜仲下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)支持，為杜仲功能基因的研究奠定了基礎(chǔ)。

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