HepG2.2.15細(xì)胞對同時(shí)包載丁香苦苷和羥基酪醇納米粒的攝取機(jī)制研究

管慶霞　李云行　呂邵娃　孫佳琳　張亮　封文靜　王利萍　李永吉

摘要：目的 考察HepG2.2.15細(xì)胞對同時(shí)包載丁香苦苷和羥基酪醇納米粒（nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol，SH-NPs）的攝取機(jī)制。方法 采用沉淀法制備SH-NPs，以異硫氰酸熒光素為熒光標(biāo)記物，采用流式細(xì)胞儀研究HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs的攝取機(jī)制。結(jié)果 秋水仙素為抑制劑，孵育時(shí)間在0.5～24 h范圍內(nèi)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)由1.9%增加到56.4%；藥物濃度為125、250、500 ?g/mL時(shí)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為4.9%、3.4%、3.9%。氯喹為抑制劑，孵育時(shí)間在0.5～24 h范圍內(nèi)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)由7.4%增加到55.4%；藥物濃度為125、250、500 ?g/mL時(shí)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為19.5%、22.5%、27.6%。結(jié)論 秋水仙素與氯喹對HepG2.2.15細(xì)胞攝取有抑制作用，且HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs的攝取與藥物濃度、孵育時(shí)間呈正相關(guān)，推斷HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs細(xì)胞的攝取機(jī)制為非特異性吸附內(nèi)吞。

關(guān)鍵詞：丁香苦苷；羥基酪醇；聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物納米粒；HepG2.2.15細(xì)胞；攝取機(jī)制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.018

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0081-05

Abstract： Objective To investigate the uptake mechanism of HepG2.2.15 cells to the nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol （SH-NPs）. Methods The nanoparticles were prepared by using a nanoprecipitation method with mPEG-PLGA as nano-carrier co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. The uptake mechanism of HepG2.2.15 cells to SH-NPs was studied by fluorescence microscopy and flow cytometry using fluoresceineisothiocyanate （FITC） as a fluorescent marker. Results With colchicine as the inhibitor， the incubation time ranged from 0.5 to 24 h， the percentage of positive cells increased from 1.9% to 56.4%； When the drug concentration was 125， 250 ?g/mL and 500 ?g/mL， the positive cell percentages were 4.9%， 3.4% and 3.9%. With chloroquine as the inhibitor； the incubation time ranged from 0.5 to 24 h， the percentage of positive cells increased from 7.4% to 55.4%； When the drug concentration was 125， 250 and 500 ?g/mL， the percentage of positive cells was 19.5%， 22.5% and 27.6%. Conclusion Colchicine and chloroquine have an inhibitory effect on HepG2.2.15 cells uptake， and the uptake of SH-NPs in HepG2.2.15 cells was positively correlated with drug concentration and incubation time. It can be concluded that the uptake mechanism of HepG2.2.15 cells to SH-NPs was nonspecific adsorption endocytosis.

Keywords： syringopicroside； hydroxytyrosol； mPEG-PLGA nanoparticles； HepG2.2.15 cells； uptake mechanism

丁香苦苷（syringopicroside）和羥基酪醇（hydroxytyrosol）是木犀科植物洋丁香、朝鮮丁香或紫丁香干燥葉中的活性物質(zhì)，二者體內(nèi)代謝迅速，穩(wěn)定性及肝靶向性差，常規(guī)給藥途徑不利于藥效的發(fā)揮。近年來，由于肝癌發(fā)病率逐漸增高，因此，開發(fā)提高丁香苦苷和羥基酪醇靶向于肝細(xì)胞的新型遞藥系統(tǒng)是目前亟需解決的問題。

中藥納米遞藥系統(tǒng)不僅具有較強(qiáng)的靶向性，而且在生物利用度和緩釋功能方面也具有較大優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，納米粒（NPs）的表面用聚乙二醇（PEG）等親水性的高分子材料修飾后，能夠形成一層水化保護(hù)膜，減少巨噬細(xì)胞對納米粒的識別和吞噬，同時(shí)能延長納米粒血液循環(huán)時(shí)間，從而產(chǎn)生緩釋作用，提高生物利用度，降低毒副作用，為藥物輸送提供了新途徑[1-2]。本課題組將二者制備成聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物（monomethoxy polyethylene glycol-poly lactide- co-glycolide，mPEG-PLGA）納米遞藥系統(tǒng)，并且于前期進(jìn)行了關(guān)于同時(shí)包載丁香苦苷和羥基酪醇納米粒（nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol，SH-NPs）的制劑性狀研究，結(jié)果表明，SH-NPs總包封率為（32.38±2.76）%，總藥物負(fù)荷為（12.01±0.42）%，粒徑為（91.70±2.11）nm，多分散指數(shù)為0.22±0.01，通過透射電子顯微鏡觀察， SH-NPs顆粒形態(tài)圓整，均勻分布，且對肝臟具有較強(qiáng)的靶向性[3]，同時(shí)，經(jīng)過HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs攝取研究，發(fā)現(xiàn)SH-NPs能夠被HepG2.2.15細(xì)胞攝取，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞攝取機(jī)制的研究，選擇秋水仙素和氯喹為內(nèi)吞抑制劑，以異硫氰酸熒光素（fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC）為熒光標(biāo)記物，用納米沉淀法制備SH-NPs，以HepG2.2.15細(xì)胞為模型細(xì)胞，借助流式細(xì)胞儀研究HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs的細(xì)胞攝取機(jī)制，為存在肝靶向性差、穩(wěn)定性差、半衰期短等缺陷的藥物的納米化提供新思路。

1 細(xì)胞、儀器與試藥

HepG2.2.15細(xì)胞株（上海博谷公司），空白NPs（自制）。

HFsafe-1200型超凈工作臺（Heal Force公司），HZQ-C型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），H2050R型離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），液氮罐（成都金鳳有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning），BD Accuri C6型流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinson and Company），RPMI-1640液體培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），10%優(yōu)級胎牛血清（美國Hyclone 公司），胰蛋白酶（美國Hyclone公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德公司），雙抗（青霉素/鏈霉素，華北制藥廠），胰蛋白酶（美國Hyclone公司），碘化丙啶（PI，南京凱基公司），SH-NPs凍干粉（自制），F(xiàn)ITC（Sigma公司，批號20130608），秋水仙素（美國Acros organics公司），氯喹（美國Acros organics公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 SH-NPs與FITC標(biāo)記的SH-NPs制備

采用納米沉淀法制備納米粒[4]，精密稱量10%mPEG-PLGA共聚物20 mg，分散于10 mL丙酮中，超聲使其溶解，形成有機(jī)相。向14.1 mg丁香苦苷和羥基酪醇混合物中加入FITC熒光標(biāo)記物3 mg或不加入FITC，分散于有機(jī)相中，超聲溶解，配制濃度為0.1%F-68溶液21 mL，形成水相。在1000 r/min磁力攪拌條件下，將有機(jī)相滴加到水相中，滴畢，于細(xì)胞破碎儀超聲60 s，磁力攪拌1000 r/min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 ℃）除去有機(jī)溶劑，即得FITC標(biāo)記的SH-NPs（FITC-SH-NPs）或SH-NPs。

2.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將密度為1×104 cfu/mL的HepG2.2.15細(xì)胞播撒在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。分別取FITC-SH-NPs、FITC溶液和空白NPs與細(xì)胞共孵育24 h。孵育后，用1 mL PBS清洗3次，消化細(xì)胞，置于相應(yīng)Ep管中，1000 r/min離心5 min，最后用1 mL PBS重懸細(xì)胞。選用與FITC激發(fā)波長相近的激發(fā)光通道，用流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞的攝取情況。結(jié)果見圖1?？瞻譔Ps和FITC溶液與HepG2.2.15細(xì)胞作用后，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)很低，分別為1.9%、3.9%，細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有熒光，表明空白NPs本身無熒光，且FITC分子在本實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間內(nèi)不能進(jìn)入細(xì)胞，排除了空白NPs和FITC分子對結(jié)果的影響。

2.3 秋水仙素對細(xì)胞攝取抑制作用的考察

秋水仙素是一種微管形成抑制劑，能與微管蛋白結(jié)合，使微管解聚。微管不僅能維持細(xì)胞的形態(tài)，更重要的是負(fù)責(zé)將細(xì)胞器從細(xì)胞內(nèi)的一處移到另一處，如將內(nèi)吞形成的小泡從細(xì)胞膜移開，為形成更多的內(nèi)吞小泡騰出空間。一旦微管解聚，內(nèi)吞形成的小泡從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)體受到抑制，內(nèi)吞受阻。本實(shí)驗(yàn)通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入內(nèi)吞抑制劑秋水仙素研究細(xì)胞攝取過程，結(jié)果見圖2。與對照組比較，在同一濃度、同一時(shí)間抑制組對細(xì)胞攝取的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為5.4%，而不加秋水仙素的對照組對細(xì)胞攝取的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為49.9%，表明秋水仙素對細(xì)胞攝取有較強(qiáng)的抑制作用。

2.3.1 時(shí)間秋水仙素細(xì)胞攝取抑制作用的影響

細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中貼壁生長后，提前3 h在抑制組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入360 ?g/mL秋水仙素，對照組細(xì)胞培養(yǎng)液中不加任何抑制劑，分別加入500 ?g/mL FITC-SH-NPs溶液，于37 ℃孵育0.5、1、2、4、24 h，PBS沖洗細(xì)胞3次，胰蛋白酶消化細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測，考察時(shí)間對細(xì)胞攝取抑制作用的影響，結(jié)果見圖3。與對照組比較，抑制組陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低，細(xì)胞作用0.5、l、2 h的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)相似，分別為1.9%、2.9%、4.3%，表明秋水仙素對細(xì)胞攝取的抑制作用很強(qiáng)；隨著FITC-SH-NPs與細(xì)胞孵育時(shí)間的延長（4、24 h），陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加至42.9%、56.4%，表明秋水仙素對細(xì)胞攝取的抑制作用隨時(shí)間延長逐漸減弱。

2.3.2 濃度對秋水仙素細(xì)胞攝取抑制作用的影響

細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中貼壁生長后，提前3 h在抑制組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入360 ?g/mL秋水仙素，對照組的細(xì)胞培養(yǎng)液中不加任何抑制劑，分別加入125、250、500 ?g/mL FITC-SH-NPs溶液，于37 ℃孵育2 h，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，用流式細(xì)胞儀測定，考察不同濃度FITC-SH-NPs對細(xì)胞攝取抑制作用的影響，結(jié)果見圖4。與對照組比較，抑制組的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯降低，表明秋水仙素對細(xì)胞攝取存在抑制作用。125、250、500 ?g/mL FITC-SH-NPs在秋水仙素抑制后孵育相同時(shí)間，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為4.9%、3.4%、3.9%。

2.4 氯喹對細(xì)胞攝取抑制作用的考察

氯喹是一種趨溶酶體試劑，為弱堿性，能抑制核內(nèi)體的成熟，阻斷內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的粒子從早期核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)到晚期核內(nèi)體以及從晚期核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，同時(shí)升高細(xì)胞內(nèi)酸性細(xì)胞器（溶酶體、核內(nèi)體）的pH值。本實(shí)驗(yàn)通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入內(nèi)吞抑制劑氯喹研究細(xì)胞攝取過程，結(jié)果見圖5。與對照組比較，氯喹抑制組對細(xì)胞攝取有較強(qiáng)抑制作用。

2.4.1 時(shí)間對氯喹細(xì)胞攝取抑制作用的影響

細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中貼壁生長后，提前l(fā) h在抑制組的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入516 ?g/mL氯喹，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，考察不同孵育時(shí)間（0.5、1、2、4、24 h）對細(xì)胞攝取抑制作用的影響，結(jié)果見圖6。與對照組比較，抑制組陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低，當(dāng)細(xì)胞與FITC-SH-NPs共孵育0.5、l h時(shí)，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對照組低，分別為7.4%、9.7%，隨著孵育時(shí)間的延長（2、4、24 h），陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加至16.5%、38.6%、55.4%，抑制作用逐漸減弱，表明氯喹對FITC-SH-NPs的細(xì)胞攝取有抑制作用，且與孵育時(shí)間相關(guān)。

2.4.2 濃度對氯喹細(xì)胞攝取抑制作用的影響

細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中貼壁生長后，提前l(fā) h在抑制組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入516 ?g/mL氯喹，按“2.3.2”項(xiàng)下方法考察FITC-SH-NPs濃度對細(xì)胞攝取抑制作用的影響，結(jié)果見圖7。125、250、500 ?g/mL FITC-SH-NPs與細(xì)胞共孵育，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無明顯差異，分別為19.5 %、22.5%、27.6%，表明短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞攝取不受濃度影響，抑制作用基本維持在同一水平。

3 討論

近年來關(guān)于納米載體的細(xì)胞攝取研究較多。體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為測定生物材料的生物相容性提供了有效的研究方法，通過這項(xiàng)技術(shù)可以研究細(xì)胞和納米載體材料間的相互作用，以納米粒粒徑、電位、包封率、載藥量及體外釋藥行為為考察因素，考察納米載體的細(xì)胞攝取機(jī)制[5]。納米載體的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)是判斷藥物是否靶向于細(xì)胞內(nèi)的常用方法，體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為測定生物材料的生物相容性提供了有效的研究方法，通過此項(xiàng)技術(shù)可研究細(xì)胞和納米載體材料間的相互作用[6]。而熒光標(biāo)記技術(shù)可簡單快速地進(jìn)行細(xì)胞攝取的定性、定量研究，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合上述技術(shù)，選擇2種內(nèi)吞抑制劑對SH-NPs的細(xì)胞攝取機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

由于不同類型的納米遞藥系統(tǒng)在與細(xì)胞相互作用時(shí)會呈現(xiàn)不同的分布和動力學(xué)行為，不同結(jié)構(gòu)的納米載體與細(xì)胞膜之間的相互作用力也有所區(qū)別，因此，細(xì)胞對納米給藥系統(tǒng)的內(nèi)化過程也存在差異。目前被認(rèn)可的觀點(diǎn)是，納米載體攜帶著大分子藥物，通過與細(xì)胞表面的靜電力、氫鍵等非特異性物理吸附，以吸附性內(nèi)吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，完成細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)[7-10]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)吞抑制劑秋水仙素和氯喹進(jìn)行細(xì)胞攝取機(jī)制的研究，以FITC為熒光標(biāo)記物，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的攝取情況，通過分析結(jié)果可知，秋水仙素和氯喹均能一定程度抑制HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs的攝取，且HepG2.2.15細(xì)胞對SH-NPs的攝取與藥物濃度、孵育時(shí)間呈正相關(guān)，由此可以推斷，SH-NPs被細(xì)胞內(nèi)在化的過程為非特異性吸附內(nèi)吞。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)，豐富了對納米粒的研究內(nèi)容，但仍需進(jìn)一步深入。

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（收稿日期：2017-06-10）

（修回日期：2017-07-05；編輯：陳靜）