陳 贊,林 朗,楊宗哨,李丕宏,陳上住
(1.蒼南縣人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 溫州 325800;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 普外科,浙江 溫州 325000)
結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,全球結(jié)腸癌的發(fā)生率和死亡率位于惡性腫瘤的第三位[1-3]。細(xì)胞生長(zhǎng)增殖失調(diào)是腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制之一[4-5],腸道微生物種群及宿主與微生物的相互作用可能是結(jié)腸癌發(fā)生另一重要機(jī)制[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7-8],嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌具有多種益生作用,如阻止致病菌定植、誘發(fā)腸道免疫、降低膽固醇、控制內(nèi)毒素、制造營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、刺激組織發(fā)育等。本研究旨在探討嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制。
1.1試劑和儀器益生菌菌種購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)公司,胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司,兔抗人Bax多克隆抗體、抗GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司,四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自Corning公司,垂直電泳儀、BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,qRT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司,PCR儀購(gòu)自ABI公司。
1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司,接種于含10%胎牛血清(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)的改良型RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2,細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行研究。
1.3菌體成分制備將純化并鑒定后的嗜酸乳桿菌(ATCC 4356)、乳雙歧桿菌(CGMCC1.2226)和長(zhǎng)雙歧桿菌(ATCC 15708)接種于皰肉培養(yǎng)基(無(wú)水硫酸鎂0.1 g,多胨12 g,磷酸氫二鈉11 g,植胨3 g,酵母粉3 g,硫代硫酸鈉1.0 g,可溶性淀粉3 g,牛肉渣1 g,pH 7.8,高壓滅菌121 ℃,15 min)進(jìn)行培養(yǎng),達(dá)到足量的益生菌菌體濃度后通過(guò)超聲破碎及高速低溫離心,分離得到細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)成分。
1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 RPMI1640 培養(yǎng)液重懸SW-480細(xì)胞,按細(xì)胞數(shù)密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL、每孔100 μL接種到96孔板。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入益生菌活菌體、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì),采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量。益生菌活菌體細(xì)胞數(shù)與SW-480細(xì)胞數(shù)比例分別為 1∶1、10∶1、50∶1,益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的濃度分別為10、50、100、200 μg/mL。每組設(shè)置五個(gè)復(fù)孔,每組空白對(duì)照不加任何處理因素。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,37 ℃培養(yǎng)48 h后加入5 mg/mL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后棄去細(xì)胞上清液體,再向各孔中加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)震蕩孵育10 min。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值,抑制率 =(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白對(duì)照吸光值)×100 %。
1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)Bcl-2表達(dá)將SW480細(xì)胞37 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后,利用Trizol法提取總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈,參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平,以GAPDH作為內(nèi)參,GAPDH上游引物5'-GACCCCTTCATTGACCTCAA-3',下游引物5'-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'。Bcl-2上游引物5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’,下游引物5’- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。
1.6Western blot法檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)將SW480細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,37 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后,預(yù)冷PBS沖洗2次后加入100 μL的細(xì)胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑10 mg/mL)提取總蛋白,按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)操作,兔抗人的Bax多克隆抗體(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)稀釋,以GAPDH為內(nèi)參照,加化學(xué)發(fā)光劑顯色,Bax蛋白表達(dá)情況通過(guò)Image J軟件計(jì)算蛋白灰度進(jìn)行量化。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1益生菌菌體對(duì)SW-480細(xì)胞增殖的影響嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長(zhǎng)雙歧桿菌菌體分別與SW-480細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,均抑制SW-480細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,見(jiàn)表1。
表1 益生菌菌體對(duì)人結(jié)腸癌
2.2益生菌細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞的抑制作用10、50、100、200 μg/mL的益生菌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁成分分別作用于SW-480細(xì)胞48 h,分析對(duì)SW-480細(xì)胞抑制率計(jì)算各組半抑制濃度(IC50)值。三組益生菌細(xì)胞壁成分的抑制作用均大于細(xì)胞質(zhì)成分,其中乳雙歧桿菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng),見(jiàn)表2。
表2 益生菌成分作用
2.3益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響三種益生菌的細(xì)胞壁成分處理SW-480細(xì)胞48 h,qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白對(duì)照(0.97±0.3)比較,嗜酸乳桿菌(0.71±0.4)、乳雙歧桿菌(0.53±0.1)與長(zhǎng)雙歧桿菌(0.63±0.3)三組的Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。
與空白對(duì)照比較,*P < 0.05;**P < 0.01圖1 益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響(48 h)
2.4益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bax表達(dá)的影響三種益生菌的細(xì)胞壁成分處理SW-480細(xì)胞48 h,與空白對(duì)照(0.52±0.11)比較,嗜酸乳桿菌(0.69±0.18)、乳雙歧桿菌(0.81±0.10)與長(zhǎng)雙歧桿菌(0.73±0.12)三組的Bax表達(dá)均提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。
與空白對(duì)照比較,*P < 0.05圖2 Western blot法檢測(cè)益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bax表達(dá)的影響(48 h)
目前用于治療結(jié)腸癌的臨床藥物種類繁多,然而這些藥物都有不同程度的副作用[9]。因此,研發(fā)新型的結(jié)腸癌靶向治療藥物是近些年的關(guān)注重點(diǎn)。應(yīng)用細(xì)菌治療腫瘤具有悠久的歷史[10],但細(xì)菌毒性等因素限制了其研究與臨床應(yīng)用。隨著相關(guān)益生菌研究技術(shù)的提高,為消化系統(tǒng)腫瘤治療的研究提供了新思路[11]。益生菌已被建議作為一種新的預(yù)防和治療結(jié)腸癌的選擇。
益生菌具有改善腸道健康作用,是平衡菌群功能的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑,也是一種取代平衡系統(tǒng)中的菌系作用的微生物添加物。研究表明[8],益生菌有阻礙致病菌在腸道定植,誘導(dǎo)腸道免疫,降低膽固醇,制造營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),刺激組織發(fā)育等功能,可有效預(yù)防或抑制宿主結(jié)腸癌癥的發(fā)生。益生菌提高人體的免疫機(jī)能、抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制已逐漸引起學(xué)者們的關(guān)注,攝入益生菌L.caseiZhang可通過(guò)Claudin15- CLIC4 信號(hào)途徑預(yù)防結(jié)腸癌,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究顯示,攝入保加利亞酸乳可以抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)[12];Jacouton等[13]研究發(fā)現(xiàn),益生菌L.caseiBL23可通過(guò)上調(diào)caspase-7,caspase-9和Bik等機(jī)制顯著減少氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的結(jié)腸癌小鼠模型中的腫瘤形成,提示該益生菌有望成為抗結(jié)腸癌生物制品。本研究MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長(zhǎng)雙歧桿菌可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)濃度依賴性,進(jìn)一步證實(shí)了益生菌可抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)。為了解益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)抗結(jié)腸癌能力,本研究分離益生菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)分別作用于結(jié)腸癌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三組益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)均有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用,并且細(xì)胞壁的抑制作用均大于細(xì)胞質(zhì)。
結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,細(xì)胞增殖失控是腫瘤發(fā)生的初始階段。益生菌可通過(guò)線粒體途徑調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,抑制增殖。Russo 等[14]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillusrhamnosus菌株細(xì)胞質(zhì)可以通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá),顯著抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究進(jìn)一步觀察了嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長(zhǎng)雙歧桿菌的細(xì)胞壁成分對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平及Bax表達(dá)水平的影響,結(jié)果顯示,三種益生菌細(xì)胞壁均可抑制Bcl-2表達(dá),提高Bax表達(dá)水平,提示嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長(zhǎng)雙歧桿菌可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
綜上所述,嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌三種益生菌均可抑制SW-480細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)有關(guān)。