高壓氧預(yù)處理對大鼠腦出血后炎癥反應(yīng)的影響

施振華, 裘五四,程　軍, 姜啟周, 秦智勇

(1.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 杭州310015；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 神經(jīng)外科，上海210040)

高壓氧預(yù)處理(hyperbaric oxygen preconditioning, HBOP)是指在機(jī)體受到損傷前預(yù)先給予高壓氧處理。HBOP與其他預(yù)處理方式如缺血、缺氧等預(yù)適應(yīng)相仿，能誘導(dǎo)對心臟、肝臟、腦、脊髓等器官的缺血再灌注損傷耐受[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，HBOP同樣能減輕大鼠腦出血(intracranial hemorrhage, ICH)后腦水腫，對誘導(dǎo)ICH后的腦損傷耐受，但其機(jī)理未完全闡明。ICH 后腦水腫形成早期主要與凝血酶相關(guān)，后期(ICH 72 h后)主要與血紅蛋白及其降解產(chǎn)物(如鐵離子等毒性產(chǎn)物)對周圍組織的繼發(fā)性損傷(如炎癥反應(yīng))相關(guān)[4-5]。本研究通過觀察HBOP對大鼠ICH后血清白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)含量及血腫周圍炎癥細(xì)胞浸潤的影響，進(jìn)一步探討HBOP誘導(dǎo)腦損傷耐受的機(jī)理。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組選用雄性Spradgue-Dawley大鼠72 只，體重280～320 g，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為HBOP組和對照組各36 只，HBOP組給予高壓氧預(yù)處理，對照組給予假預(yù)處理。最后一次預(yù)處理結(jié)束24 h后，采用自體動脈血腦內(nèi)注射法[3]建立ICH模型。

1.2主要試劑與儀器DWC150/300型動物實(shí)驗(yàn)用高壓氧艙購自上海七零一所楊園高壓氧艙有限公司，ALC-H型實(shí)驗(yàn)動物立體定向儀購自上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司, ALC-H型微量注射泵購自上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)inesse ME+型石蠟切片機(jī)購自賽默飛世爾 ，TD-5型離心沉淀機(jī)購自成都一科儀器設(shè)備有限公司，AMR-100型全自動酶標(biāo)儀購自杭州奧盛；IL-1β、IL-6檢測試劑盒購自武漢博士德生物，醫(yī)用氧氣購自海天氣體，1%戊巴比妥鈉、1%PBS液、4 %多聚甲醛溶液購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.3高壓氧預(yù)處理與假預(yù)處理 HBOP組大鼠連續(xù)5 d每日置入高壓氧艙內(nèi)，以醫(yī)用純氧作氣源(通過調(diào)節(jié)進(jìn)出口氣流量維持實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)99%以上)勻速緩慢加壓至3個(gè)絕對大氣壓后維持氧艙內(nèi)壓力平穩(wěn)，持續(xù)1 h后均勻緩慢降壓至1個(gè)絕對大氣壓。對照組大鼠連續(xù)5 d每日置入高壓氧艙內(nèi)，但只暴露于1個(gè)絕對大氣壓的空氣中，每次暴露時(shí)間同HBOP組。

1.4ICH模型建立1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(40 mg/kg)后，大鼠頭部固定于動物立體定向儀上。頭部及股部常規(guī)備皮、消毒，切開皮膚后局部分離直至暴露右側(cè)股動脈，置入靜脈留置針以備用。頭皮正中切開以暴露大鼠右側(cè)冠狀縫，使用針頭鉆孔備用，位置為距中線旁開約3.5 mm處的冠狀縫上。用微量注射器在大鼠股動脈留置針處快速取自體動脈血100 μL，連接針頭后自顱骨鉆孔處垂直進(jìn)針，深度為自硬腦膜起5.5 mm，用微量注射泵在10 min內(nèi)勻速注入。注射結(jié)束后稍留針頭片刻后小心緩慢退針，隨后封閉顱骨孔，縫合頭皮。

1.5神經(jīng)功能評分在ICH模型建立后24 h、48 h、72 h各時(shí)間點(diǎn)，采用前肢放置試驗(yàn)[2]判斷大鼠神經(jīng)功能缺損的程度，每次正確放置記1分，放置試驗(yàn)共觀察10次。

1.6IL-1β、IL-6含量測定ICH模型建立后72 h，大鼠尾取血，采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定血清IL-1β、IL-6含量，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7HE染色及病理學(xué)觀察ICH模型建立后72 h，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(55 mg/kg)，常規(guī)開胸后自大鼠左心室灌注1 %PBS緩沖液直至右心房流出清亮液體，再灌注4 %多聚甲醛，灌注完畢后斷頭，使用咬骨鉗小心剝離大鼠顱骨后取腦，使用4 %多聚甲醛溶液固定腦組織，常規(guī)脫水后石蠟包埋，4 μm層厚切片，常規(guī)HE染色后400倍光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評分大鼠ICH模型建立24 h后兩組神經(jīng)功能評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；建模48 h、72 h后的HBOP組大鼠神經(jīng)功能評分均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2IL-1β、IL-6含量ICH建模后72 h，HBOP組大鼠尾靜脈血清IL-1β含量(7.59±1.96 pg/mL)低于對照組(13.38±3.87 pg/mL)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBOP組大鼠尾靜脈血清IL-6含量(75.78±6.4 pg/mL)低于對照組(148.69±26.8 pg/mL)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠ICH建模后72 h血腫周圍細(xì)胞腫脹肥大，其周圍邊界模糊，HBOP組大鼠ICH建模后72 h后血腫周圍細(xì)胞腫脹輕，邊界相對較清晰，炎癥細(xì)胞浸潤范圍輕于對照組，見圖2。

與對照組比較，*P<0.05。圖1　兩組大鼠前肢放置試驗(yàn)評分

對照組　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 HBOP組圖2　大鼠右側(cè)基底血腫周圍腦組織HE染色圖(×400)

3　討論

Wada等[6]首先報(bào)道了HBOP誘導(dǎo)的缺血損傷耐受現(xiàn)象，連續(xù)5次高壓氧預(yù)處理(2個(gè)絕對大氣壓，100%氧氣，每天1次，連續(xù)5 d)能顯著減輕沙鼠腦缺血后的腦損傷效應(yīng)。此后多位學(xué)者研究表明HBOP能顯著減輕大鼠腦缺血后損傷灶周圍的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[1，7-8]。為明確在HBOP誘導(dǎo)的缺血損傷耐受效應(yīng)中起關(guān)鍵作用的是高壓還是高氧亦或是兩者均有作用，Dong等[9]比較了HBOP及單純高壓預(yù)處理對家兔脊髓缺血損傷的作用，發(fā)現(xiàn)HBOP(即高壓及氧聯(lián)合)而并非單純高壓誘導(dǎo)了缺血損傷耐受效應(yīng)。Qin等[2]研究發(fā)現(xiàn)，HBOP同樣能誘導(dǎo)對大鼠ICH后的腦損傷耐受。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)HBOP能顯著減輕大鼠ICH后腦水腫及血腦屏障破壞，但其機(jī)理仍未完全闡明[10]。本研究通過建立大鼠基底節(jié)ICH模型觀察HBOP對大鼠ICH后炎癥反應(yīng)的影響，探討HBOP誘導(dǎo)ICH后對神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制。

ICH的死亡率及致殘率極高[11]，ICH后的繼發(fā)性腦損害如腦水腫是影響其預(yù)后的重要因素[12]。ICH后的炎癥反應(yīng)顯著加重了ICH后的繼發(fā)性腦損害效應(yīng)[5]。ICH后炎癥反應(yīng)過程是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，ICH后期(72 h以后)，血紅蛋白及其降解產(chǎn)物(如鐵離子等)的毒性作用以及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是腦水腫形成過程的重要因素[4]，IL-1β是IL-1的一種存在形式，它在炎癥反應(yīng)中起著多重作用[5，13-14]。研究表明[5]，IL-1β能刺激粘附分子的表達(dá)，增加白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，使白細(xì)胞聚集在出血灶周圍，并促使內(nèi)皮細(xì)胞激活血液中的凝血酶原的毒性作用，增加白細(xì)胞的聚集，從而加重繼發(fā)性腦損傷及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)IL-1β又能激活巨噬細(xì)胞和星形細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Holmin等[15]發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)注入微量的IL-1β即可誘導(dǎo)短暫的炎癥反應(yīng)并出現(xiàn)神經(jīng)凋亡細(xì)胞。IL-6是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的重要致炎細(xì)胞因子，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮多重作用[5，16]。IL-6既有促炎又有抗炎作用，高濃度的IL-6增加粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，促使白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，加重ICH后的腦損傷[5]。本研究結(jié)果顯示，HBOP明顯下調(diào)了大鼠ICH建模后72 h血清IL-1β及IL-6的含量，減少了血腫周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度，推測ICH后單核-巨噬細(xì)胞的浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子如IL-1β及IL-6，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而加重了繼發(fā)性腦損傷；HBOP能減輕炎癥細(xì)胞的浸潤，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，減輕ICH后繼發(fā)性腦損傷，改善神經(jīng)功能缺損。另外，本研究并未就血腫周圍的炎癥細(xì)胞種類進(jìn)行對比，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上，HBOP可改善大鼠ICH后神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可能是HBOP減輕大鼠ICH后繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制之一。HBOP預(yù)處理方式相對安全、無創(chuàng)，給神經(jīng)外科病人如何預(yù)防及減少術(shù)后繼發(fā)性腦損傷提供了新的思路。