菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1的克隆及表達分析

劉洪磊,張雅芬,余佳佳,葉子弘

(中國計量大學 生命科學學院,浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018)

茭白(ZizanialatffoliaTurez.)又稱“菰”,是長江中下游地區(qū)重要經(jīng)濟作物,也是我國第二大水生蔬菜.余永年認為是菰黑粉菌侵入茭白植株,誘使植株產(chǎn)生大量吲哚乙酸,從而刺激茭白基部膨大形成了肉質(zhì)鮮美的可食用茭白[1].在正常茭白中,菰黑粉菌多以菌絲形態(tài)存在,稱為MT型,而在灰茭中,菰黑粉菌在侵染早期即形成大量肉眼可見的褐色冬孢子堆,稱為T型[2].對茭白不同生長階段的組織中菰黑粉菌的分布進行顯微觀察,發(fā)現(xiàn)在茭白膨大初期,菌絲急劇生長[3-4].所以,菰黑粉菌菌量的迅速累積和雙核菌絲的生長可能是茭白植株孕茭的重要原因.

研究表明,黑粉菌的菌絲生長及增殖與其二型態(tài)轉(zhuǎn)變密切相關(guān),主要受環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信號途徑來調(diào)控其極性生長,并通過絲裂原活化蛋白激酶MAPK(mitogen activated protein kinase)信號途徑控制細胞延伸過程,共同作用于細胞融合及菌絲生長,從而實現(xiàn)侵染和擴散[5].在菰黑粉菌近緣真菌玉米瘤黑粉菌中,a信息素信號和受體通過cAMP和MAPK信號途徑影響性親和單倍體菌株融合形成雙核菌絲,從而影響致病性[6-7].研究表明,玉米瘤黑粉菌缺失Rak1后,其接合管形成能力減弱,細胞融合形成雙核菌絲概率大大降低[8];當MAPK信號途徑被激活或加入一定濃度的外源cAMP,Rak1缺失的性親和菌株的接合管形成能力恢復[8].因此Rak1可能參與激活cAMP/PKA和MAPK信號途徑,從而參與調(diào)控細胞生長、融合[8].進一步研究發(fā)現(xiàn),Rak1可能是prf1激活子rop1的調(diào)節(jié)因子,從而實現(xiàn)信息素和信息素受體基因表達的調(diào)控[8].

WD-重復蛋白是一個含有多個高度保守的GH(glycine-histidine)和WD(tryptophan-aspartic acid)序列的蛋白家族,保守結(jié)構(gòu)域由40個左右的氨基酸殘基組成.該蛋白家族由許多結(jié)構(gòu)相關(guān)、功能不同的調(diào)控蛋白組成,在信號轉(zhuǎn)導、蛋白運輸和RNA加工等過程中具有重要作用[9].實驗室前期分別從龍茭2號正常茭和灰茭中分離出MT型和T型菰黑粉菌,本研究以此為研究材料,通過菰黑粉菌基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),菰黑粉菌存在一個具有7個WD40結(jié)構(gòu)域的基因,并經(jīng)PCR克隆后獲得了候選基因的基因組序列和CDS序列.經(jīng)系統(tǒng)進化樹分析及對WD40保守結(jié)構(gòu)域進行同源性比對分析,發(fā)現(xiàn)該候選基因與玉米瘤黑粉菌Rak1的同源性最高,故命名為UeRak1.MT型和T型菰黑粉菌融合生長試驗顯示:MT型在細胞融合及菌絲生長能力上均弱于T型.熒光定量PCR檢測表明:在細胞融合時期及菌絲生長初期UeRak1的表達量急劇上升,在菌絲大量生長后UeRak1的表達量又有所下降,同時結(jié)果顯示,在細胞融合生長過程中,T型菰黑粉菌中UeRak1的表達量是MT型的2倍以上.結(jié)合MT型較弱的細胞融合生長能力,我們推測UeRak1基因與菰黑粉菌細胞融合和菌絲生長有關(guān).該結(jié)果有助于深入研究菰黑粉菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)化.

1　材料方法

1.1　菌株及培養(yǎng)條件

以分離自龍茭2號正常茭和灰茭的MT-1和T-1菌株為試驗菌株,在YEPS培養(yǎng)基(酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、蔗糖20 g/L,瓊脂糖15 g/L)中劃線培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28 ℃.

1.2　UeRak1基因的克隆及分析

將培養(yǎng)的菰黑粉菌在液氮中充分研磨,按照Trizol試劑說明書提供的方法提取菰黑粉菌總RNA,采用PrimeScriptRT regent Kit With gDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第一鏈.根據(jù)已有基因組數(shù)據(jù)信息設(shè)計引物UeRak1-F1、UeRak1-R1(表1),通過普通PCR擴增、瓊脂糖凝膠回收獲得目標片段.將目標片段連接PMD19-T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,挑取轉(zhuǎn)化子送測序確認.通過NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預測該序列結(jié)構(gòu).按照CTAB的方法提取菰黑粉菌DNA.再按照UeRak1基因序列設(shè)計特異引物UeRak1-F2、UeRak1-R2以菰黑粉菌基因組DNA為模板獲得UeRak1目的基因.

1.3　融合試驗

將固體培養(yǎng)的菰黑粉菌接種到Y(jié)EPS液體培養(yǎng)基,180 r/min、28 ℃培養(yǎng)至菌含量OD600為1.0左右.5 000 r/min離心5 min后收集菌體并以YEPS液體培養(yǎng)基稀釋成菌含量為2.0,分別將T-1型和MT-1型中的一對性親和菰黑粉菌1∶1混合后,滴加在YEPS固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng),此時為0 h.此后每隔12 h觀察取樣,至60 h.實驗進行3次重復.

1.4　熒光實時定量PCR檢測基因的相對表達量

將融合試驗的樣本提取菰黑粉菌總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,方法參考2.2.按照實時定量PCR的引物設(shè)計要求設(shè)計相關(guān)引物(表1).以菰黑粉菌β-actin基因作為內(nèi)參.qPCR采用20 μL體系,以SYBR Green為染料,使用StepOneTMReal-Time PCR System(ABI)進行qPCR反應.PCR反應體系為:10 μL SYBR Premix Ex TaqTM,0.5 μL Primer(10 μM),0.5 μL cDNA模板,加DEPC水至總體積為20 μL.反應程序為95℃ 30 s;95 ℃ 30 s,54 ℃ 20 s,72 ℃30 s,循環(huán)40次,每個樣品做3管重復.綜合考量標準曲線和Ct值,采用2-ΔΔCt法計算UeRak1基因的相對表達量.

表1　實驗相關(guān)引物列表

2　結(jié)果與分析

2.1　菰黑粉菌UeRak1基因的克隆及序列分析

前期研究表明玉米瘤黑粉菌中存在一個含有WD40-重復序列的蛋白Rak1,在細胞融合和生長中起著重要作用.近期,我們完成了菰黑粉菌的基因組測序工作,在分析過程中預測菰黑粉菌中可能也存在一個編碼WD40-重復蛋白的基因.如圖1，根據(jù)基因組預測序列我們設(shè)計了特異性引物UeRak1-F1、UeRak1-R1,擴增得到菰黑粉菌中一段2 388 bp左右的基因組序列,確認了基因組中存在該預測序列.接下來,我們根據(jù)基因片段測序結(jié)果和結(jié)構(gòu)預測設(shè)計開放閱讀框引物Uegpa3-F2和Uegpa3-R2對基因組DNA進行擴增,克隆得到1 994 bp的基因組序列,以引物Uegpa3-F2和Uegpa3-R2對cDNA進行擴增,獲得1 020 bp的CDS序列,經(jīng)測序驗證,CDD數(shù)據(jù)庫比對確認為完整序列.將基因組序列和CDS序列比對后發(fā)現(xiàn),該基因存在1個大小為974 bp的內(nèi)含子.

1—2388 bp長度的基因組DNA擴增片段;2—完整的UeRak1基因序列,1 994 bp長度的基因組DNA擴增片段;3—1 020 bp長度的cDNA擴增片段.M-DNA Maker (DL2000 DNA Maker, Takara);箭頭所指的都是測序的條帶.圖1　UeRak1cDNA和基因組片段擴增瓊脂凝膠電泳Figure 1　Agarose gel electrophoresis of the UeRak1 cDNA and genomic fragments

經(jīng)ExPasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)預測,該基因編碼339個氨基酸,蛋白相對分子質(zhì)量約為37.47 kDa,理論等電點為6.38.通過NCBI中的BLAST比對發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白與其他真菌中的Gβ亞基及其相似結(jié)構(gòu)的同源性極高,尤其是玉米黑粉菌的Rak1蛋白,因此我們將該基因命名為UeRak1(GenBank登錄號KT343767).

2.2　UeRak1蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對UeRak1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預測分析,結(jié)果表明該蛋白具有典型的WD40-重復結(jié)構(gòu)域(7個WD40重復序列)和精氨酸-HDAC-超家族結(jié)構(gòu)域(圖2),與G蛋白β亞基物同源.很多真核蛋白都具有WD40結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域含有7個葉狀的β螺旋結(jié)構(gòu),在生命過程中起著重要的作用,例如RACK1是哺乳類細胞中普遍存在的一種骨架蛋白,是蛋白激酶C受體,也存在保守的WD40結(jié)構(gòu)域,該β-螺旋槳結(jié)構(gòu)的支架蛋白具有整合不同信號通路集成輸出的作用,并通過調(diào)控核糖體的聚集來影響蛋白翻譯過程[9-11].在真菌中也存在RACK1同源物,比如粟酒裂殖酵母中的CPC2[12](SchizosaccharomycespombeCAB11079.1)、釀酒酵母中的ASC1[13](SaccharomycescerevisiaeAJT01249.1)和玉米瘤黑粉菌中的Rak1蛋白[8](UstilagomaydisXP_011388829.1),已有研究表明,它們不僅與真菌的有性生殖有關(guān),與真菌的菌絲生長和致病性等也存在密切的聯(lián)系.精氨酸-HDAC-超家族則在不同細胞生命過程中起著重要作用,包括細胞周期調(diào)控、細胞因子信號轉(zhuǎn)導等.基于此,我們將該氨基酸序列與其它真菌中Gβ亞基、Gβ亞基同源物RACK1及RACK1同源物CPC2、ASC1和Rak1的氨基酸序列通過MEGA6軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌中UeRak1蛋白與玉米絲黑穗病菌(SporisoriumreilianumSRZ2 CBQ71151.1)、賓地瘤黑粉菌(Melanopsichiumpennsylvanicum4 CDI55376.1)、擔子類酵母菌(PseudozymabrasiliensisEST05924.1)和大麥堅黑粉菌(UstilagohordeiCCF48119.1)中的CPC2蛋白及玉米瘤黑粉菌中的Rak1蛋白聚為一個分支,說明與其親緣關(guān)系最近.而與釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、花藥黑粉菌(MicrobotryumviolaceumKDE05309.1)等真菌中的Gβ蛋白或Gβ亞基同源CPC2及果蠅(DrosophilayakubaXP_002087998.1)和人(HomosapiensNP_006089)中的具有WD40結(jié)構(gòu)域的RACK1蛋白的親緣性較遠(圖3).進一步通過DNAMAN軟件對菰黑粉菌及與其親緣關(guān)系較近的四種真菌中的Gβ同源物CPC2和Rak1氨基酸序列中保守結(jié)構(gòu)域進行比對分析,如圖4結(jié)果顯示:WD40重復序列結(jié)構(gòu)域(7-309)在不同真菌中的保守性極高,相似度也較高,僅少數(shù)幾個位點的氨基酸不同,表明菰黑粉菌中該蛋白可能也參與真菌的菌絲生長、致病性和有性生殖的過程.

圖2　UeRak1保守結(jié)構(gòu)域示意圖Figure 2　The blast result of conserved domain in UeRak1

圖3　UeRak1系統(tǒng)進化分析Figure 3　Phylogenetic analysis of UeRak1

圖4　UeRak1與其它真菌中的WD40結(jié)構(gòu)域多序列比對Figure 4　Putative amino sequence alignment with the WD40 domain of UeRak1 with its homologs

2.3　UeRak1基因與菌絲的形成有關(guān)

A-0 h;B-12 h;C-24h;D-36 h圖5　不同培養(yǎng)時間下菰黑粉菌中UeRak1基因的差異表達分析Figure 5　Differential expression analysis of UeRak1 gene during different growth time

前期研究發(fā)現(xiàn),MT型和T型菰黑粉菌在細胞體外融合生長中存在差異性,表現(xiàn)為在同等試驗條件下,MT型的細胞融合生長更少更慢，如圖5.本研究選取了分別分分離自正常茭的MT-1和灰茭T-1中的一對性親和單倍體菌株,在融合試驗前單倍體菌株呈酵母形態(tài),(圖6A,0 h),后期細胞開始融合(圖6B,12 h),后形成雙核菌絲(圖6C,24 h),最后菌轉(zhuǎn)為菌絲型生長,形成白色氣生菌絲(圖6D,36 h).運用實時熒光定量PCR,分別在0、12、24、36、48、60、h檢測UeRak1的表達變化情況,如圖5.結(jié)果顯示:菰黑粉菌MT-1和T-1中UeRak1的表達趨勢基本沒有差別;在細胞融合生長期(0-24 h,圖6B,C),UeRak1的表達量急劇升高;當融合培養(yǎng)36 h后,氣生菌絲開始生長(圖6D),此時表達量開始下降.而MT-1菌株中UeRak1基因的表達量均不到T-1菌株的一半.綜合分析不同培養(yǎng)時間和不同菌落形態(tài)下UeRak1基因的相對表達量差異,推測UeRak1基因與菰黑粉菌細胞融合和菌絲生長具有緊密的聯(lián)系.

圖6　融合試驗后菰黑粉菌細胞形態(tài)(上)和菌落型態(tài)圖(下)Figure 6　Morphology of cells and colonis after cell fusion of Ustilago esculenta

3　討　論

茭白是中國長江流域及以南地區(qū)頗受喜愛的一種水生蔬菜,因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、具有一定藥用價值,因此是我國南方一種重要的經(jīng)濟作物.前期眾多研究表明茭白植株中存在一種共生菌——菰黑粉菌,它參與茭白植株可食用肉質(zhì)莖的形成,研究發(fā)現(xiàn)在茭白膨大初期就可檢測到菌絲的存在,并隨著茭白的膨大形成菌絲簇[1,3].已有研究表明,真菌的致病性與它的菌絲的生長狀態(tài)有著密切得聯(lián)系,如釀酒酵母與玉米瘤黑粉菌[13-14],所以研究菰黑粉菌從酵母型向菌絲型的轉(zhuǎn)變過程對闡明菰黑粉菌侵染茭白植株的意義重大.大量研究表明,菰黑粉菌與玉米瘤黑粉菌親緣關(guān)系較近,在玉米瘤黑粉菌的酵母型向菌絲型完成轉(zhuǎn)變后,可以侵入植株并通過吸收宿主的養(yǎng)分來完成有性生殖過程,且在該過程中MAPK和cAMP/PKA信號途徑具有重要的調(diào)節(jié)作用[6-7].在玉米瘤黑粉菌中發(fā)現(xiàn),Rak1作為MAPK和cAMP/PKA信號途徑的附加組件,參與細胞融合生長和致病性過程[8].本文第一次克隆到了菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1;結(jié)構(gòu)分析表明UeRak1具有7個重復的WD40結(jié)構(gòu)域,是CPC2/ASC1的同源物;表達分析顯示,UeRak1可能參與菰黑粉菌從酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變的過程.

本研究基于全基因組測序結(jié)果成功擴增出一段2388 bp序列,豐富了菰黑粉菌基因庫.經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)UeRak1與其它真菌中的WD40-重復蛋白具有極高的相似度,且WD40結(jié)構(gòu)域同源性在96%以上(圖4),表明該基因在物種間相對比較保守,與已有研究結(jié)果類似,即WD-重復蛋白是一個具有高度保守的WD序列但是功能各異的蛋白大家族.而且雖然已經(jīng)克隆出很多編碼WD-重復蛋白的基因,但是大部分WD-重復蛋白的功能和調(diào)控機理都還不清楚.對菰黑粉菌中該基因的克隆鑒定及后續(xù)的功能研究,不但能更好地了解該基因在菰黑粉菌中的作用,也能更好地了解和掌握WD-重復蛋白家族的性質(zhì)和功能.

在菰黑粉菌融合試驗中,0～24 h為性親和單倍體細胞融合生長的時間段,培養(yǎng)36 h后開始有較明顯的菌絲生長,而MT-1型菰黑粉菌融合生長的細胞數(shù)量及菌絲生長速度均少于T-1型(圖6).實時熒光定量PCR結(jié)果顯示UeRak1在12 h和24 h時表達量最高,之后就開始下降(圖5).與其生長狀態(tài)比對后,我們推測UeRak1是細胞融合生長所必須的.

在玉米瘤黑粉菌中,cAMP/PKA和MAPK信號途徑分別參與調(diào)控真菌的芽殖和細胞延伸過程,兩個信號途徑協(xié)同調(diào)控a、b基因及prf1,從而調(diào)控真菌的融合生長及致病性[15-17].其中,具有7個WD40重復序列保守域的Rak1蛋白缺失菌株中,prf1、a基因的表達量下調(diào)[8].本研究克隆得到的UeRak1基因與玉米瘤黑粉菌具有92%的相似度,它們的WD40保守序列具有99.7%的相似度(圖4),說明UeRak1與Rak1極有可能具有相似的功能.熒光定量PCR的研究結(jié)果也表明UeRak1基因可能參與菰黑粉菌酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變的過程.該研究結(jié)果預示著UeRak1蛋白可能參與菰黑粉菌的細胞融合生長等過程.因此,有必要進一步對UeRak1與cAMP/PKA和MAPK信號途徑的聯(lián)系進行研究,進而闡述UeRak1基因在菰黑粉菌菌絲融合生長及致病性中的作用及其機制.