二色補血草總黃酮對功能性子宮出血模型大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9表達的影響

歐莉，苗彥霞，呂娟，衛(wèi)培峰

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西　咸陽　712046)

無排卵型功能失調(diào)性子宮出血(Anovulatory Dysfunctional Uterine Bleeding,ADUB)又被稱為無排卵型功血，是一種發(fā)病率較高的婦科內(nèi)分泌疾病，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂，經(jīng)期時長時短，出血量過多或表現(xiàn)為不規(guī)則出血，屬中醫(yī)學(xué)“崩漏”的范疇[1-2]。二色補血草來源于白花丹科補血草屬的多年生草本植物，全草入藥;主要分布于遼寧、河北、甘肅、陜西、江蘇、內(nèi)蒙古等地。味甘、微苦，性微溫,入脾、肝、膀胱經(jīng)，有化瘀止血、益血通脈的功效，主治月經(jīng)失調(diào)、崩漏下血、鼻衄、外傷出血等[3]。ADUB的發(fā)病機制目前尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)可能是由于神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)，子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境出現(xiàn)改變，子宮內(nèi)膜修復(fù)不能正常完成，導(dǎo)致子宮異常性出血[4]。子宮微環(huán)境中存在大量的生長因子、血管活性物質(zhì)、蛋白酶及細胞外基質(zhì)，均參與了功血的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗組前期的研究發(fā)現(xiàn),二色補血草中主要成分總黃酮能通過雌激素樣物質(zhì)與孕激素樣物質(zhì)的共同協(xié)同作用治療ADUB[5-6]，但其如何作用于子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境以及與血管新生的相關(guān)性目前尚不清楚。本文通過大鼠去勢造模并利用雌激素負荷法建立ADUB子宮內(nèi)膜增生癥大鼠模型，并觀察給予二色補血草總黃酮，大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達水平的變化，以期進一步解釋其治療ADUB的作用機制。

1　材料

1.1　儀器設(shè)備

恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9075A型，上海一恒科技有限公司)；高速臺式離心機(TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；電泳儀(型號WS300，河北萬生博朗電子有限公司)；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(型號ZF-288，上海嘉鵬科技有限公司)；彩色病理圖像分析儀(型號M305487，西化儀——科技有限公司)；熒光定量PCR儀(型號7300，美國(北京)應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI公司)。

1.2　藥物

參照文獻[7]提取二色補血草總黃酮。料液比1∶10，濃度60%的乙醇為提取劑，回流提取3次，每次40 min。提取總黃酮后濃縮至38.8 mg/ml，4℃保存?zhèn)溆谩m血寧膠囊(0.13 g×18粒/盒，云南白藥集團股份有限公司，批號20160724);苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司，1 mg/ml，批號1606171)。

1.3　試劑

兔抗大鼠VEGF、TIMP-1抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒和SABC試劑盒(武漢博士德生物制品有限公司)；RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；大鼠VEGF引物、大鼠TIMP-1引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；Trans DNA Marker Ⅰ、PCR supermixⅠ、Ⅱ(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.4　動物

SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(陜)2012-003。

2　方法

2.1　動物分組及造模

選取60只健康雌性SD大鼠，每組10只，隨機分為6組：空白對照組、模型對照組、二色補血草總黃酮低、中、高劑量組和宮血寧組。除空白對照組外，其余大鼠手術(shù)取出雙側(cè)卵巢，術(shù)后第3天肌注苯甲酸雌二醇注射液(無菌花生油稀釋至0.15 mg/ml)，隔日1次，連續(xù)給藥14 d?？瞻讓φ战M進行開關(guān)腹手術(shù)，術(shù)后第3天肌注相同體積無菌花生油[8]。

二色補血草總黃酮低、中、高劑量組分別灌胃給予二色補血草總黃酮97 mg/kg，194 mg/kg，388 mg/kg；宮血寧組灌胃給予宮血寧膠囊水溶液70 mg/kg；空白對照組和模型對照組灌胃給予相同體積的蒸餾水。去勢造模后第7 d開始灌胃給藥，1次/天，連續(xù)給藥14 d。第14天給藥后處死大鼠，將大鼠子宮表面的脂肪組織去掉后冰浴中分為兩部分，液氮速凍后-70℃冰箱保存。

2.2　S-P免疫組化法檢測各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9的表達

將子宮內(nèi)膜組織置10 %多聚甲醛中固定，石蠟包埋，5 μm切片；采用免疫組化S-P法對切片進行染色。切片常規(guī)脫蠟水化后，滴加稀釋倍數(shù)為1:250的一抗，4℃孵育過夜，滴加生物素標記IgG工作液，37℃孵育30 min，滴加ABC復(fù)合物后37℃孵育20 min，滴加DAB顯色液，37℃10 min，脫水后透明、封膠。采用彩色病理圖像分析儀的圖文分析系統(tǒng)對切片進行分析，隨機選擇3個視野/切片，雙盲法觀察，讀取平均數(shù)。

2.3　RT-PCR法分析大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA的表達

將液氮冷凍的大鼠子宮內(nèi)膜組織研成粉末，按試劑盒提取總RNA，用TransScript RT/RI Enzyme Mix合成第一鏈cDNA，DNA擴增，RT-PCR反應(yīng)條件為：預(yù)防性94℃，5 min。變性94℃，1 min；退火55℃，1 min；延伸72℃，2 min；共35個循環(huán)，循環(huán)后延伸，72℃，7 min。實驗時用β-actin作為內(nèi)參。VEGF、MMP-9、β-actin引物見表1。

表1　RT-PCR 中所用引物序列

3　結(jié)果

3.1　各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組的大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白表達水平均出現(xiàn)顯著性升高(P<0.01),提示子宮內(nèi)膜異常增生，造模成功；與模型對照組比較，二色補血草總黃酮各組VEGF、MMP-9蛋白表達水平均有所降低，其中二色補血草總黃酮的高劑量組VEGF蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，MMP-9的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2　二色補血草總黃酮對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9表達的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.2　各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA表達水平明顯升高(P<0.05),MMP-9 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，二色補血草總黃酮中、高劑量組VEGF mRNA和MMP-9 mRNA表達水平均出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3　二色補血草總黃酮對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA表達的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4　討論

ADUB患者由于無孕激素拮抗的雌激素長期刺激，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜管腔變大、靜脈毛細血管增加，提高了血管脆性，其發(fā)展過程與血管生成密切相關(guān)。VEGF主要作用于血管內(nèi)皮細胞，是血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原，主要通過與血管內(nèi)皮細胞表面的特異性受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)血管生成。VEGF可促進微血管擴張，增加血管通透性，被認為是調(diào)控血管生成作用最強和特異性最高的調(diào)控因子[9-10]。病理情況下，VEGF可引起子宮內(nèi)膜血管過度增生，增加血管滲透性并改變血管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致子宮異常出血?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅依賴內(nèi)肽酶類，能降解絕大多數(shù)細胞的細胞外基質(zhì)和膠原，主要表達在子宮內(nèi)膜腺上皮、間質(zhì)及血管基底膜上[11]。研究表明，子宮內(nèi)膜組織缺乏孕酮時可促使MMP-9的合成與分泌，而正常生理濃度的孕酮幾乎完全抑制MMP-9的合成與分泌。當孕酮撤退，子宮內(nèi)膜上皮細胞和間質(zhì)細胞在表皮生長因子和血管生長因子等細胞因子的作用下，通過旁分泌或自分泌形式產(chǎn)生大量MMP-9。MMP-9過度表達，既增加血管基膜的降解，又促進了炎性細胞的浸潤，導(dǎo)致血管完整性被破壞，并出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，最終影響子宮內(nèi)膜的正常修復(fù)，導(dǎo)致子宮異常性出血。此外，VEGF與其受體KDR結(jié)合可增加MMP-9的表達水平，從而降解膠原纖維，增加血管脆性增加，進一步導(dǎo)致纖維蛋白水解，止血作用下降出現(xiàn)異常出血[12]。

本實驗結(jié)果顯示，造模后大鼠VEGF和MMP-9的蛋白和mRNA表達水平均出現(xiàn)顯著性增加，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異常增生。給予二色補血草總黃酮后，高劑量組可明顯降低大鼠子宮內(nèi)膜VEGF和MMP-9的蛋白和mRNA表達水平；中劑量組可明顯降低大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9的mRNA表達水平及VEGF的蛋白水平。說明二色補血草總黃酮治療ADUB的機制可能是通過下調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，引起MMP-9的表達水平下降，減輕子宮內(nèi)膜血管脆性從而達到止血的目的。