3月齡α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的改變

徐玉鈺 馬澤剛

[摘要]目的探討α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠早期認(rèn)知功能的改變及其可能的機(jī)制。

方法選取3月齡α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，采用新物體識(shí)別和轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能，采用Western Blot方法觀察小鼠海馬和前額葉皮質(zhì)內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)的方法觀察小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。

結(jié)果新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)表明，與野生型小鼠相比，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。Western Blot檢測顯示，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬和前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF的表達(dá)較野生型小鼠下調(diào)（t=2.584、4.189，P<0.05）。A53T轉(zhuǎn)基因小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間與野生型小鼠相比差異無顯著性（P>0.05），黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目與野生型小鼠相比也無明顯改變（P>0.05）。

結(jié)論3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙且早于運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]A53T小鼠;認(rèn)知功能障礙;帕金森病;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

[中圖分類號(hào)]R741

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 20965532（2018）02020204

帕金森病（PD）是一種常見的神經(jīng)退變性疾病，其病理表現(xiàn)主要是黑質(zhì)致密部多巴胺（DA）能神經(jīng)元的選擇性死亡和腦內(nèi)路易小體的形成[13]。α突觸核蛋白是PD特征性病理標(biāo)志物路易小體的主要成分，在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元中廣泛存在[45]。在某些因素作用下，α突觸核蛋白可發(fā)生構(gòu)象變化形成聚集體，并引起DA能神經(jīng)元的死亡[4，6]。PD經(jīng)典的運(yùn)動(dòng)癥狀包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢不穩(wěn)等[7]。然而，一些非運(yùn)動(dòng)癥狀如嗅覺障礙、認(rèn)知

[LL]能力下降、記憶力減退等可在運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)之前發(fā)生或伴隨著運(yùn)動(dòng)癥狀而發(fā)生[812]。目前，PD的研究多集中在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)上。但有研究表明，只有當(dāng)黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元損傷或缺失達(dá)到80%以上時(shí)，才能出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)癥狀[13]。因此，對PD早期非運(yùn)動(dòng)癥狀進(jìn)行研究并在發(fā)病前及時(shí)干預(yù)，將有利于延緩或阻止PD的發(fā)病進(jìn)程。α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶了人突變型α突觸核蛋白A53T基因，且其運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)較晚，可模擬PD發(fā)病過程中神經(jīng)病理學(xué)過程的改變，是研究PD早期非運(yùn)動(dòng)癥狀的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究以該模型鼠為?shí)驗(yàn)對象，探討PD早期認(rèn)知功能的改變以及可能的機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用試劑除做特別說明外，均購自美國Sigma公司。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）抗體為美國abcam公司產(chǎn)品，βactin抗體為中國博奧森公司產(chǎn)品。選取20只雄性健康3月齡C57/BL6小鼠（其中A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠各10只），體質(zhì)量（22±2）g，由安徽博源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)溫度為（19±2）℃，12 h/12 h晝夜自動(dòng)循環(huán)光照，自由進(jìn)食、飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)可以評估小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。小鼠首先被放置在靜置的轉(zhuǎn)棒上適應(yīng)2 min，然后旋轉(zhuǎn)桿以4～40 r/min均勻加速共5 min。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠掉下轉(zhuǎn)棒或在轉(zhuǎn)棒上連續(xù)跑超過5 min，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)停止，并記錄小鼠停留在旋轉(zhuǎn)桿上的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)每天測試3次，連續(xù)3 d，取平均值。每次測試時(shí)間間隔不小于1 h。

1.2.2新物體識(shí)別該實(shí)驗(yàn)周期為5 d。前3 d是適應(yīng)期：每只小鼠放置在測試箱內(nèi)熟悉環(huán)境，測試箱內(nèi)不放置任何物品，10 min后把小鼠放回原飼養(yǎng)籠內(nèi)。第4天為熟悉期：將小鼠放回裝有兩個(gè)完全相同物體的測試箱中，讓小鼠自由探索，訓(xùn)練持續(xù)10 min。第5天為測試期：先讓小鼠在測試箱內(nèi)自由探索兩個(gè)相同的物體10 min，1 h后進(jìn)行記憶測試。測試期和熟悉期過程類似，只是測試箱內(nèi)的兩個(gè)相同的物體中的一個(gè)被改變，測試5 min。每次測試結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇清洗物體和箱子，以減少物體上的氣味。如果小鼠在1 cm之內(nèi)指向或用鼻子觸及物體，則視為探索行為。用攝像機(jī)記錄測試視頻，離線分析并記錄小鼠對新舊物體的探索時(shí)間。

1.2.3酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經(jīng)元免疫熒光化學(xué)染色行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取5只小鼠用80 g/L水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉，先用37 ℃生理鹽水灌注心臟15 min，待流出的液體變清澈后，快速換成40 g/L多聚甲醛灌注10 min，然后在冰上快速斷頭取腦。用40 g/L多聚甲醛在4 ℃下固定6 h，300 g/L蔗糖脫水24～48 h后，用包埋液將整個(gè)腦組織包埋后，進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，切片厚度為20 μm。將收集的腦片放置在24孔板中，進(jìn)行黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元熒光染色及計(jì)數(shù)。1×PBS沖洗3次后，將腦片放置在配置好的兔抗小鼠TH一抗（1∶2 000）中，每孔300 μL，4 ℃搖床過夜。1×PBS沖洗3次后，每孔加入300 μL的山羊抗兔熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育2 h。1×PBS沖洗3次后，將腦片貼于載玻片上并用體積分?jǐn)?shù)0.70甘油封片。使用蔡司顯微鏡進(jìn)行掃描，計(jì)數(shù)黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元總數(shù)。

1.2.4Western Blot方法檢測海馬和前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白的表達(dá)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，每組取5只小鼠，冰上快速斷頭取腦，分離出左右兩側(cè)海馬和前額葉，分別稱質(zhì)量后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。? mg組織中加入100 μL混合裂解液（RIPA與PMSF以體積分?jǐn)?shù)99∶1混合而成），研磨成勻漿，于冰上靜置裂解30 min。4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸出上清，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)過SDSPAGE電泳并濕轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上。切出帶有目的蛋白的條帶，用50 g/L脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，分別用BDNF（1∶500）、βactin（1∶10 000）一抗于4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，分別用羊抗鼠HRPIgG（1∶10 000）和羊抗兔HRPIgG（1∶10 000）二抗室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，用LSUVP Vision WorksTM LS軟件掃描后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用 Students t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1A53T轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠認(rèn)知功能比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠對新物體的探索時(shí)間為（52.70±4.96）s，對舊物體的探索時(shí)間為（45.24±2.51）s，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠對新舊物體的探索時(shí)間比較差異無顯著性（P>0.05）;野生型小鼠對新物體的探索時(shí)間為（62.23±4.32）s，對舊物體的探索時(shí)間為（44.87±1.79）s，野生型小鼠對新物體的探索時(shí)間明顯長于對舊物體的探索時(shí)間（t=3.283，P<0.01）。兩組小鼠對新舊兩種物體的總探索時(shí)間差異無顯著性（P>0.05）。

2.2A53T轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠海馬和前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白水平比較

A53T轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠海馬的BDNF

水平分別為0.691 8±0.063 4和1.025 0±0.112 1，兩組比較差異有顯著意義（t=2.584，P<0.05）。A53T轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠腦前額葉皮質(zhì)的BDNF水平分別為0.300 8±0.033 4和0.466 6±0.023 7，兩組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.189，P<0.01）。

2.3A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力比較

野生型小鼠停留在旋轉(zhuǎn)桿的時(shí)間為（267.1±7.4）s，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠為（274.8±10.0）s，兩組比較差異無顯著性（P>0.05）。

2.4A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目比較

野生型小鼠的黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元為（6 945±

261）個(gè)，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠為（6 194±316）個(gè)，兩組比較差異無顯著性（P>0.05）。

3討論

DA作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可控制情緒和運(yùn)動(dòng)能力[14]。本文研究結(jié)果顯示，3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力并無改變，且其黑質(zhì)區(qū)DA標(biāo)志物TH陽性神經(jīng)元數(shù)目也沒有明顯改變，提示3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)區(qū)無明顯損傷。推測調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能的紋狀體DA含量可能也沒有明顯變化，這可能是A53T轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力無明顯障礙的原因之一。

本文研究結(jié)果顯示，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠早期出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，海馬和前額葉皮質(zhì)的BDNF水平出現(xiàn)了下調(diào)。眾所周知，海馬和額葉皮質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶有著內(nèi)在的聯(lián)系，但目前尚不清楚這兩個(gè)區(qū)域的損傷是否與認(rèn)知功能障礙有關(guān)。但研究表明，海馬損傷可能導(dǎo)致動(dòng)物和人的空間記憶障礙[15]。另外，BDNF被認(rèn)為是神經(jīng)元存活的主要調(diào)節(jié)因子[1618]，BDNF基因的變化也與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病有關(guān)[1921]。

[HJ2mm]

BDNF是維持神經(jīng)元完整性和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長與分化的重要調(diào)節(jié)因子，其主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)[2223]。另外，BDNF還有修復(fù)受損神經(jīng)元，調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸功能以及參與學(xué)習(xí)記憶的功能[24]。BDNF不僅在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和DA能神經(jīng)元中廣泛分布，并且也分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他神經(jīng)元中[2526]。本文研究結(jié)果顯示，海馬和前額葉的BDNF水平均下調(diào)，這可能是A53T轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知能力下降的一個(gè)原因。有研究結(jié)果表明，

在黑質(zhì)區(qū)中正常濃度的α突觸核蛋白可以同步提

[LL]高BDNF的水平，但在黑質(zhì)中過度表達(dá)的α突觸核蛋白卻能下調(diào)BDNF的水平，這表明BDNF水平的下降也可能與突變型A53T小鼠α突觸核蛋白的聚集有關(guān)[11，2728]。還有研究顯示，老年鼠和AD病人海馬中BDNF表達(dá)均出現(xiàn)了下調(diào)[2930]。另外，有研究在其他腦區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了BDNF水平的改變，MOGI等[31]應(yīng)用ELISA技術(shù)研究顯示，PD病人黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元分布區(qū)的BDNF水平明顯低于正常對照組，BDNF濃度的改變可能與PD的發(fā)病有著某種關(guān)聯(lián)。另有研究發(fā)現(xiàn)，杏仁核是識(shí)別和調(diào)節(jié)情緒的腦區(qū)，也與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)，杏仁核內(nèi)BDNF的下調(diào)也與抑郁癥等相關(guān)[32]。但本研究中并未涉及其他腦區(qū)內(nèi)BDNF水平的變化，有待今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，在PD早期會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，且非運(yùn)動(dòng)癥狀會(huì)早于運(yùn)動(dòng)癥狀發(fā)生。在PD早期非運(yùn)動(dòng)癥狀中，認(rèn)知功能障礙是最容易被發(fā)現(xiàn)的，但目前并不清楚出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的確切原因。認(rèn)知能力的下降可能是早期PD海馬功能受損和腦相關(guān)區(qū)域BDNF水平下降所致。如能在運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)之前及時(shí)診斷PD并進(jìn)行干預(yù)，可減輕PD病人的痛苦。本文結(jié)果也為治療PD病人認(rèn)知功能障礙提供了一個(gè)有效的靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]TOLLESON C M， FANG J Y. Advances in the mechanisms of Parkinsons disease[J]. Discovery Medicine， 2013，15（80）：6166.

[2]陳偉賢，張賽. 帕金森病的診斷和治療[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)， 2015，13（5）：692693.

[3]DISSANAYAKA N N， LAWSON R A， YARNALL A J， et al. Anxiety is associated with cognitive impairment in newlydiagnosed Parkinsons disease[J]. Parkinsonism & Related Disorders， 2017，36（1）：6368.

[4]GUBELLINI P， KACHIDIAN P. Animal models of Parkinsons disease： an updated overview[J]. Revue Neurologique， 2015，171（11）：750761.

[5]PUSPITA L， CHUNG S Y， SHIM J W. Oxidative stress and cellular pathologies in Parkinsons disease[J]. Molecular Brain， 2017，10（1）：5357.

[6]TOLMASOV M， DJALDETTI R， LEV N， et al. Pathological and clinical aspects of alpha/beta synuclein in Parkinsons di

sease and related disorders[J]. Expert Review of Neurotherapeutics， 2016，16（5）：505513.

[7]KANSARA S， TRIVEDI A， CHEN Sheng， et al. Early diagnosis and therapy of Parkinsons disease： can disease progres

sion be curbed[J]？ Journal of Neural Transmission （Vienna，Austria：1996）， 2013，120（1）：197210.

[8]SHIMIZU S， OHNO Y. Improving the treatment of Parkinsons disease： a novel approach by modulating 5HT（1A） receptors[J]. Aging and Disease， 2013，4（1）：113.

[9]OZANSOY M， BASAK A N. The central theme of Parkinsons disease： αsynuclein[J]. Molecular Neurobiology， 2013，47（2）：460465.

[10]KWON K Y， LEE H M， LEE S M， et al. Comparison of motor and nonmotor features between essential tremor and tre

mor dominant Parkinsons disease[J]. Journal of the Neurological Sciences， 2016，361（15）：3438.

[11]GRAH M， MIHANOVIC M， RULJANCIC N， et al. Brainderived neurotrophic factor as a suicide factor in mental disorders[J]. Acta Neuropsychiatrica， 2014，26（6）：356363.

[12]KONNO T， DEUTSCHLANDER A， HECKMAN M G， et al. Comparison of clinical features among Parkinsons disease subtypes： a large retrospective study in a single center[J]. Journal of the Neurological Sciences， 2018，386（1）：3945.

[13]BERNHEIMER H， BIRKMAYER W， HORNYKIEWICZ O， et al. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington. Clinical， morphological and neurochemical correlations[J]. Journal of the Neurological Sciences， 1973，20（4）：415455.

[14]CHANG P K， YU L， CHEN J C. Dopamine D3 receptor blockade rescues hyperdopamine activityinduced deficit in novel object recognition memory[J]. Neuropharmacology， 2018，133（1）：216223.

[15]KHALIL H， ALOMARI M A， KHABOUR O F， et al. Relationship of circulatory BDNF with cognitive deficits in people with Parkinsons disease[J]. Journal of the Neurological Sciences， 2016，362（15）：217220.

[16]WANG Q M， WANG G L， MA Z G. Protective effects of myricetin on chronic stressinduced cognitive deficits[J]. Neuro Report， 2016，27（9）：652658.

[17]LIU F F， XUAN Aiguo， CHEN Yan， et al. Combined effect of nerve growth factor and brainderived neurotrophic factor on neuronal differentiation of neural stem cells and the potential molecular mechanisms[J]. Molecular Medicine Reports， 2014，10（4）：17391745.

[18]YUE L P， MA L Y， CUI S， et al. Brainderived neurotrophic factor in the infralimbic cortex alleviates inflammatory pain[J]. Neuroscience Letters， 2017，655（8）：713.

[19]SIUDA J， PATALONGOGIEWA M， ZMUDA W， et al. Cognitive impairment and BDNF serum levels[J]. Neurologia I Neurochirurgia Polska， 2016，51（1）：2432.

[20]TOME D， FONSECA C P， CAMPOS F L. Role of neurotrophic factors in Parkinsons disease[J]. Current Pharmaceutical Design， 2017，23（5）：809838.

[21]SMITH P A. BDNF： no gain without pain[J]？ Neuroscience， 2014，283（283）：107123.

[22]CHAGAS M H， ZUARDI A W， TUMAS V， et al. Effects of cannabidiol in the treatment of patients with Parkinsons di

sease： an exploratory doubleblind trial[J]. Journal of Psychopharmacology （Oxford， England）， 2014，28（11）：10881098.

[23]葉心國，李濤，李翔，等. 帕金森病患者血清EGF和BDNF水平變化與認(rèn)知障礙的關(guān)系[J]. 腦與神經(jīng)疾病雜志， 2016，24（7）：406409.

[24]HAN Z M， HUANG H M， WANG F F. Brainderived neurotrophic factor genemodified bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Experimental and Therapeutic Medicine， 2015，9（2）：519522.

[25]DA SILVA P G， DOMINGUES D D， DE CARVALHO L A， et al. Neurotrophic factors in Parkinsons disease are regulated by exercise： evidencebased practice[J]. Journal of the Neurological Sciences， 2016，363（8）：515.

[26]TRONCI E， NAPOLITANO F， MUNOZ A， et al. BDNF overexpression induces striatal serotonin fiber sprouting and increases the susceptibility to lDOPAinduced dyskinesia in 6OHDAlesioned rats[J]. Experimental Neurology， 2017，297（3）：7381.

[27]FANG F， YANG W L， FLORIO J B， et al. Synuclein impairs trafficking and signaling of BDNF in a mouse model of Parkinsons disease[J]. Scientific Reports， 2017，7（1）：3868.

[28]劉佳，黃永璐，高宗良. 血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與老年帕金森病患者認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性[J]. 中國老年學(xué)雜志， 2015，35（21）：61936194.

[29]LEDREUX A， BOGER H A， HINSON V K， et al. BDNF levels are increased by aminoindan and rasagiline in a double lesion model of Parkinsons disease[J]. Brain Research， 2016，1631（19）：3445.

[30]趙淑杰，朱雨嵐. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響[J]. 中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志， 2015，18（13）：4041.

[31]MOGI M， TOGARI A， KONDO T， et al. Brainderived growth factor and nerve growth factor concentrations are decreased in the substantia nigra in Parkinsons disease[J]. Neuroscience Letters， 1999，270（1）：4548.

[32]GUILLOUX J P， DOUILLARDGUILLOUX G， KOTA R， et al. Molecular evidence for BDNFand GABArelated dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression[J]. Molecular Psychiatry， 2012，17（11）：11301142.

（本文編輯黃建鄉(xiāng)）