桑寄生總黃酮對大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型的影響

王紅麗 管俊 馮靜 牛源菲 王曉丹 崔瑛

摘要 目的：觀察桑寄生總黃酮（TFHT）對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的藥理作用。方法：雄性SD大鼠，測量1次/7 d足趾腫脹度及進(jìn)行1次關(guān)節(jié)評分。第22天給藥后將大鼠處死，取左后足踝關(guān)節(jié)（除正常給藥組大鼠外）做病理切片觀察；酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清中TNF-α、IL-10、IL-6的含量。結(jié)果：TFHT高、中劑量組能夠明顯改善佐劑性關(guān)節(jié)炎組大鼠足趾腫脹程度及大鼠全身癥狀；降低免疫器官系數(shù)；降低血清中IL-6、TNF-α的含量，升高IL-10的含量；病理切片顯示踝關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯減輕，滲出物及血管翳生成減少或無；提示桑寄生總黃酮具有顯著的祛風(fēng)濕和逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)破壞的作用。結(jié)論：桑寄生總黃酮具有明顯的祛風(fēng)濕作用，其作用機(jī)制與降低血清中IL-6、TNF-α的含量，升高IL-10的含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 桑寄生總黃酮；佐劑性關(guān)節(jié)炎；炎性反應(yīng)因子

Abstract Objective：To study the pharmacological effect of total flavonoids of Herba Taxilli （TFHT） on adjuvant arthritis in rats.Methods：All male SD rats were injected with Freund′s complete adjuvant on the left foot to establish adjuvant joint model.From the beginning of the 9th day of administration，normal group and model group were given 0.5% sodium carboxymethylcellulose （CMC-Na） solution by gavage，while the positive control group was given tripterygium glycosides suspension 1 mg/mL.TFHT high，middle and low dose group were given 360 mg/kg，180 mg/kg，90 mg/kg CMC-Na solution for 22 days.The left rear ankle joint diameter of rats were measured and graded every 7 days from the 15th day of modeling.After 22th day，the rats were sacrificed，and the left hind ankle joints （except the normal administration group） were observed for pathological sections.TNF-α，IL-10 and IL-6 in serum were determined by Elisa.Results：TFHT high and middle dose group significantly improved the degree of swelling of the toes and the systemic symptoms of rats in adjuvant arthritis group； decreased the immune organ coefficient； decreased the levels of IL-6 and TNF-α，increased IL-10 content.Pathological sections showed ankle cartilage destruction was significantly reduced，exudate and pannus formation decreased or even disappered.Pharmacodynamics experiments showed that TFHT had significant rheumatism and reversal of bone and joint damage.Conclusion：TFHT has obvious effects of anti-rheumatism，whose pharmacological mechanisms are related with the reduce of IL-6 and TNF-α，as well as the rise of IL-10 in serum.

Key Words Total flavonoids of Herba Taxilli； Adjuvant arthritis； Inflammatory factors

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.004

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatic Arthritis，RA）是一種病因不可解釋的系統(tǒng)性自身免疫疾病，其特征在于進(jìn)行性的骨破壞和滑膜炎[1]，對稱小關(guān)節(jié)腫脹和疼痛為其最具典型的臨床表現(xiàn)[2]。迄今為止，全球約有16億RA患者，患病率為0.5%～1.0%，好發(fā)于65歲以上的女性[3]?；颊叨嘁躁P(guān)節(jié)疼痛為主訴，如未經(jīng)及時的治療，將會進(jìn)行性的發(fā)展成全身性關(guān)節(jié)損傷，極大的影響生命質(zhì)量[4]。RA在中醫(yī)學(xué)中被歸屬于“痹癥”范疇，痹癥的發(fā)病根源于本虛或營衛(wèi)失和，患者正氣不足，風(fēng)、寒、濕、熱邪相合成痹，機(jī)體受外邪侵襲，經(jīng)絡(luò)阻塞，氣血不調(diào)，不通則痛，治當(dāng)固本祛邪，通絡(luò)止痛，用善于祛風(fēng)濕、止痛的中草藥治療RA具有一定的優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)室前期開展了桑寄生功效物質(zhì)及歸經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)了桑寄生水煎液對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠有顯著的治療作用，其中萹蓄苷和槲皮苷為桑寄生祛風(fēng)濕的重要藥效物質(zhì)[5]。鑒于萹蓄苷和槲皮苷屬于黃酮類成分，故本實(shí)驗(yàn)以桑寄生的總黃酮部位為對象，遵循中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論及辨證施治的原則，在類似人RA的佐劑性關(guān)節(jié)炎模型上對其祛風(fēng)濕藥效進(jìn)行觀察和研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，180～200 g/只，購于山東朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20140007。將大鼠隨機(jī)標(biāo)記，分放于籠中，5只/籠。動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度調(diào)控在22～25 ℃之間，相對濕度調(diào)控在40%～50%之間，自由食水飼養(yǎng)，1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 藥物 桑寄生總黃酮，自制，純度度范圍在56.73%～62.38%之間。桑寄生總黃酮（TFHT）溶液的制備稱取一定質(zhì)量的桑寄生總黃酮，加0.5%CMC-Na溶液超聲溶解，配制成所需濃度的溶液。雷公藤多苷混懸液的制備取一定質(zhì)量的雷公藤多苷片（10 mg/片），研碎，加0.5%CMC-Na溶液超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混懸液。

1.1.3 試劑與儀器 Elisa試劑盒IL-6、IL-10、TNF-α（生產(chǎn)批號：E20160901A，艾萊薩生物科技（上海）有限公司）。弗氏完全佐劑（型號：SLBK7817V，美國SIGMA公司）；無菌生理鹽水、甲醛、羧甲基纖維素鈉均為國產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀（Bio Tek Instruments，Inc）；低速離心機(jī)（型號：DL-5-B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；多級閃蒸器（型號：JMF-320G，河南金鼎科技發(fā)展有限公司）；獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具系統(tǒng)（型號：IVC-Ⅱ，蘇州馮氏動物籠具廠）；電熱套（容量：50L，上海樹立儀器儀表有限公司）；足趾容積測量儀（型號：YLS-7C，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠不限食水，自由飲食一周后進(jìn)行試驗(yàn)，從4 ℃冰箱里取出弗氏完全佐劑，充分震蕩、搖勻5 min。模型組、陽性組、桑寄生總黃酮各劑量組用75%醫(yī)用乙醇消毒后，于大鼠左后足注射0.1 mL弗氏佐劑1次，注射以局部產(chǎn)生白泡為佳，正常組于同樣位置注射0.1 mL生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 于造模第9天開始給藥。桑寄生總黃酮高、中、低劑量組灌胃給予桑寄生總黃酮溶液（高劑量：360 mg/kg，中劑量：180 mg/kg，低劑量：90 mg/kg），陽性組給予雷公藤多苷片混懸液（10 mg/kg），正常給藥組給予桑寄生總黃酮溶液（360 mg/kg），正常組、模型組給予0.5%CMC-Na溶液。給藥體積為1.0 mL/100 g，每天早晨1次，連續(xù)給藥22 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

大鼠足趾腫脹度的測量及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的計算在每只大鼠的踝關(guān)節(jié)處同一位置做一標(biāo)記，使用足趾容積測量儀分別于致炎前及灌胃7 d、14 d、21 d后測定繼發(fā)側(cè)足趾容積1次（共4次），計算足趾腫脹度，其值用來衡量足腫脹的程度。從致炎后8 d開始，每7天進(jìn)行1次觀察評分。按五級法來給非致炎側(cè)三只肢體關(guān)節(jié)腫脹進(jìn)行評分。0級：全身足爪無明顯紅腫；1級：趾關(guān)節(jié)稍腫；2級：小趾及足趾關(guān)節(jié)紅腫；3級：足踝以下的足爪紅腫；4級：全足爪紅腫。1級算1分，累計算分，12分為最高分。采用此方法來記錄并評估繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎病的產(chǎn)生及關(guān)節(jié)障礙程度。

大鼠免疫器官指數(shù)的計算連續(xù)給藥22 d后稱取大鼠重量，給予10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉后，腹主動脈取血后迅速取出脾臟和胸腺，用生理鹽水洗凈臟器表面血污及結(jié)締組織，用吸水紙吸干水分并稱重。免疫器官指數(shù)=免疫器官重量（mg）/大鼠體重（g）。

關(guān)節(jié)病理學(xué)觀察經(jīng)腹主動脈取血、取出內(nèi)臟后，立即剝?nèi)□钻P(guān)節(jié)，除去皮毛等結(jié)締組織。迅速將踝關(guān)節(jié)標(biāo)本放于10%的福爾馬林溶液中固定48 h后用5%稀硝酸溶液進(jìn)行除鈣處理，更換除鈣液，每日2次。除鈣時間直至針刺入標(biāo)本后有若空感而停止。除鈣完成后，用蒸餾水沖洗標(biāo)本上過剩的固定液體，過夜。在室溫條件下，按次序用梯度乙醇進(jìn)行脫水，至C8H10透明后，經(jīng)包埋處理后切片，置于預(yù)處理過的載玻片上，恒溫60 ℃烤片12 h，進(jìn)行蘇木精伊紅（HE）染色法染色，顯微鏡觀察并分析。

血清中炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-10的檢測取血，靜置0.5 h后以轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，4 ℃離心10 min下進(jìn)行血清分離。分離的血清于-20 ℃條件下保存以備用。按照ELISA試劑盒說明書上的操作步驟操作，以血清內(nèi)各炎性因子的濃度為橫坐標(biāo)（X），以所測得的吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在注射弗氏完全佐劑（FCA）3 h后，大鼠左后足趾出現(xiàn)明顯的紅、腫、熱等反應(yīng)，有明顯的碰觸躲避行為；在48 h內(nèi)腫脹程度達(dá)到最大，足趾表面繃緊發(fā)亮，持續(xù)72 h后，腫脹開始消退；約造模8 d后，致炎側(cè)足趾再次出現(xiàn)腫脹；造模13 d后，模型組大鼠出現(xiàn)鼻黏膜出血、耳部紅斑、耳部及尾根部結(jié)節(jié)等典型的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)；當(dāng)造模后15 d時，非致炎側(cè)（右后足趾）出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹，病情呈進(jìn)行性發(fā)展，受累踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯變形，嚴(yán)重者甚至不能活動，伴有毛發(fā)暗淡，精神倦怠，飲食量減少，體重降低、脫毛等全身現(xiàn)象。

2.2 大鼠足腫脹度的比較 從致炎后15 d開始，TFHT高劑量組與雷公藤多苷組開始起治療效果；致炎后22 d起，與關(guān)節(jié)炎模型組比，TFHT高、中劑量組顯著抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的繼發(fā)性足腫脹程度，并可明顯降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01～0.05），其中以TFHT高劑量組和雷公藤多苷組作用最為顯著。大鼠繼發(fā)性足趾腫脹度及致炎后關(guān)節(jié)炎指數(shù)均隨灌胃治療的時間的延長而逐漸下降，說明桑寄生總黃酮劑量與關(guān)節(jié)炎的治療有一定的相關(guān)性。見表1、表2。

2.3 各組大鼠免疫器官系數(shù)的比較 與正常組比較，關(guān)節(jié)炎模型組胸腺、脾臟系數(shù)顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與關(guān)節(jié)炎模型組比較，TFHT高、中劑量組的胸腺、脾臟指數(shù)均有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01～0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-10的比較與正常對照組比較，關(guān)節(jié)炎模型組大鼠血清中的TNF-α，IL-6的含量明顯升高，IL-10的含量下降（P<0.01）。經(jīng)給予TFHT治療后，大鼠血清中TNF-α，IL-6的含量明顯降低，IL-10的含量顯著升高。其中TFHT高、中劑量組的治療效果尤佳（P<0.01～0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)的差異 在光鏡下觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)，正常組大鼠踝關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)完好，由較薄的單層滑膜細(xì)胞組成，且無滲出物，無軟骨壞死及炎性細(xì)胞浸潤。關(guān)節(jié)炎模型大鼠的滑膜細(xì)胞由單層排列轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄬优帕?，增生紊亂異常。關(guān)節(jié)腔及周邊組織有大量炎性細(xì)胞（淋巴細(xì)胞為主）浸潤，軟骨結(jié)構(gòu)不完整，斷裂及破壞，伴有軟骨細(xì)胞肥大，數(shù)目減少，有血管翳生成等現(xiàn)象。TFHT高、中劑量劑量組及雷公藤多苷組大鼠經(jīng)治療后踝關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯減輕，滲出物及血管翳生成減少或無。這些征象表明TFHT高、中劑量組有顯著的逆轉(zhuǎn)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)破壞的作用。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇 SD大鼠、wistar大鼠、Lewis大鼠常被用來建立佐劑型關(guān)節(jié)炎（AA）模型。有研究報道了3種品系的大鼠在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型上的差異，SD大鼠和Wistar大鼠的患病率和病情進(jìn)展程度均顯著高于Lewis大鼠，SD大鼠在病情進(jìn)展程度上明顯高于Wistar大鼠，各品系大鼠性別之間在患病率及病情進(jìn)展程度上無差別[6]。故本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠來建立AA模型。

3.2 關(guān)節(jié)炎模型的選擇與建立

美國細(xì)菌學(xué)家Jules Thomas Freund在上世紀(jì)50年代中期，創(chuàng)建了一種免疫性關(guān)節(jié)炎動物模型，即完全佐劑性關(guān)節(jié)炎模型（AA）。結(jié)核分枝桿菌是一種65 kD分子量的熱休克蛋白，與AA關(guān)節(jié)軟骨的自身抗原熱休克蛋白60（HSP60）有著相似度極高的結(jié)構(gòu)，它通過分子結(jié)合和交叉反應(yīng)激活來克隆狀態(tài)Ⅱ型膠原基淋巴細(xì)胞，引起自身免疫反應(yīng)[7]。AA模型大鼠關(guān)節(jié)有多發(fā)性局部紅腫，炎性反應(yīng)嚴(yán)重可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、活動障礙。病理切片可觀察到滑膜增生性病變，關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨因炎性細(xì)胞的浸潤而遭到破壞和侵蝕[8]。

本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在注射FCA3 h后，大鼠左后足趾出現(xiàn)明顯的紅、腫、熱等反應(yīng)，有明顯的碰觸躲避行為。在48 h內(nèi)腫脹程度達(dá)到最大，足趾表面繃緊發(fā)亮；持續(xù)72 h后，腫脹開始消退；約造模8 d后，致炎側(cè)足趾再次出現(xiàn)腫脹；造模13 d后，模型組大鼠出現(xiàn)鼻黏膜出血、耳部紅斑、耳部及尾根部結(jié)節(jié)等典型的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)；當(dāng)造模后15 d時，非致炎側(cè)（右后足趾）出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹，病情呈進(jìn)行性發(fā)展；受累踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯變形，嚴(yán)重者甚至不能活動，伴有毛發(fā)暗淡，精神倦怠，飲食量減少，體重降低、脫毛等全身現(xiàn)象。上述表現(xiàn)類似于人類RA。

3.3 陽性對照藥物的選擇 上世紀(jì)80年代，中藥雷公藤及其制劑雷公藤多苷片以開始在我國廣泛使用，曾作為臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、紅斑狼瘡（SLE）等免疫性疾病的一線用藥，因其具有腎毒性、生殖毒性等不良反應(yīng)，被限制使用。雷公藤多苷通過降低骨關(guān)節(jié)內(nèi)各炎性因子的水平來抑制骨關(guān)節(jié)的受到RA侵襲的程度[9]。另有研究表明，雷公藤可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡和調(diào)控NO的產(chǎn)生的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)中，給予大鼠較大劑量（20 mg/kg）雷公藤多苷混懸液灌胃后，大鼠對其耐受能力較差，出現(xiàn)了吐藥液等不良反應(yīng)，故將雷公藤多苷混懸液劑量調(diào)整到10 mg/kg，發(fā)現(xiàn)大鼠無明顯不良反應(yīng)，足趾腫脹消散較快，全身癥狀有所改善。因此，雷公藤多苷可以成為桑寄生總黃酮治療RA的陽性對照藥品，有助于抗炎及免疫藥效的評價。

3.4 關(guān)節(jié)炎模型藥效指標(biāo)

3.4.1 關(guān)節(jié)炎模型炎性因子指標(biāo) IL-6為一種主要的促炎遞質(zhì)，廣泛存在于RA患者的血清和滑液，可與膜結(jié)合受體、可溶性受體結(jié)合，可致滑膜細(xì)胞增生過度、促使血管翳生成和關(guān)節(jié)軟骨破壞等[11]。TNF-α均是由單核或巨噬細(xì)胞在病毒感染等作用下合成和分泌的炎性反應(yīng)遞質(zhì)，它的升高能破壞關(guān)節(jié)軟骨、誘發(fā)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、促進(jìn)血管生成和滑膜凋亡[12]。IL-10可以阻止LI-1β和TNF-α的生成，可拮抗RA病情的發(fā)展，起到抗炎和抑制免疫的作用。通過抑制TNF的釋放來促進(jìn)免疫復(fù)合物的清除。其降低能增加體內(nèi)的M1介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致RA炎性反應(yīng)的發(fā)生[13]。本實(shí)驗(yàn)中，TFHT高、中劑量組能夠明顯降低血清中TNF-α，IL-6的含量及升高IL-10的含量。表明桑寄生總黃酮具有顯著的祛風(fēng)濕功效。

3.4.2 免疫器官系數(shù)對關(guān)節(jié)炎模型的意義 胸腺、脾臟因含有大量的巨噬和淋巴細(xì)胞，均是機(jī)體進(jìn)行細(xì)胞免疫及體液免疫的核心器官。因此，在當(dāng)機(jī)體受到炎性反應(yīng)、腫瘤等侵害時，脾臟、胸腺均會有反應(yīng)性的增生。胸腺及脾臟的質(zhì)量變化可以反映某種藥物是否有調(diào)節(jié)及抑制免疫的作用，因此免疫器官的相對重量的的變化是免疫評價的重要指標(biāo)。大鼠經(jīng)注射FCA免疫后，大鼠的胸腺和脾臟均有不同程度的出現(xiàn)腫大。TFHT高、中劑量組均能明顯的降低大鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。提示了桑寄生總黃酮可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，阻止炎性反應(yīng)的進(jìn)展。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在注射FCA 3 h后，大鼠左后足趾出現(xiàn)明顯的紅、腫、熱等反應(yīng)，有明顯的碰觸躲避行為。連續(xù)注射一段時間后模型組大鼠出現(xiàn)鼻黏膜出血、耳部紅斑、耳部及尾根部結(jié)節(jié)等典型的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，且非致炎側(cè)（右后足趾）出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹，病情呈進(jìn)行性發(fā)展，受累踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯變形，嚴(yán)重者甚至活動障礙，伴有毛發(fā)暗淡，精神倦怠，飲食量減少，體重降低、脫毛等全身現(xiàn)象，類似于人類RA，說明造模成功。致炎后22 d起，與關(guān)節(jié)炎模型組比較，TFHT高、中劑量組顯著抑制著佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的繼發(fā)性足腫脹程度，可明顯降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）和免疫器官系數(shù)，大鼠血清中TNF-α，IL-6的含量明顯降低，IL-10的含量顯著升高。在光鏡下觀察到大鼠經(jīng)治療后踝關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯減輕，滲出物及血管翳生成減少或無。關(guān)節(jié)炎模型大鼠的病理表現(xiàn)均隨灌胃治療的時間的延長而出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，說明桑寄生總黃酮劑量與關(guān)節(jié)炎的治療有一定的相關(guān)性。

綜上所述，TFHT高、中劑量組可以改善佐劑關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)腫脹、具有顯著的祛風(fēng)濕作用，其作用機(jī)理與它可以降低IL-6、TNF-α，升高IL-10的含量有關(guān)。

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