合歡皮對小鼠焦慮行為影響及抗焦慮活性部位篩選

熊永豪 馮波 牛源菲 崔瑛 王君明 王紅麗 管俊

摘要 目的：研究合歡皮對小鼠焦慮行為的影響，并對其活性部位進(jìn)行初步篩選。方法：采用高架十字迷宮、明暗箱實驗對合歡皮水提液、醇提液及各萃取部位進(jìn)行抗焦慮研究；采用酶聯(lián)免疫法檢測腦內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）和5-羥色胺（5-HT）含量。結(jié)果：高架十字迷宮、明暗箱實驗顯示，合歡皮水提液各劑量組具有明顯的抗焦慮作用（P<0.05），合歡皮醇提液有較弱的抗焦慮作用。合歡皮水提液正丁醇萃取組及合歡皮醇提液正丁醇萃取組具有明顯的抗焦慮作用（P<0.05）；酶聯(lián)免疫實驗結(jié)果顯示，合歡皮水提液、合歡皮水提液正丁醇萃取組及合歡皮醇提液正丁醇萃取組均能明顯提高小鼠腦內(nèi)GABA含量，降低小鼠腦內(nèi)Glu含量，降低小鼠腦內(nèi)5-HT含量。結(jié)論：合歡皮對小鼠具有顯著的抗焦慮作用；其作用機(jī)制與提高小鼠腦內(nèi)GABA含量，降低小鼠腦內(nèi)Glu和5-HT含量含量有關(guān)；其發(fā)揮抗焦慮作用的活性部位主要為正丁醇部位。

關(guān)鍵詞 合歡皮；抗焦慮；高架十字迷宮；明暗箱；正丁醇部位

Abstract Objective：To study the anxiolytic effects of Cortex Albiziae on mice，and make a preliminary screening of its active site.Methods：We studied the anti-anxiety effect of water extraction of Albizia，alcohol extraction and various parts of Albizia extraction by the elevated plus maze，light-dark.The contents of GABA，Glu，5-HT in brain were detected by ELISA.Results：The results of elevated plus maze and light-dark experiments showed that each dose group of water extraction of Cortex Albiziae had a significant anxiolytic effect （P<0.05），and each dose group of Cortex Albiziae alcohol extract didn′t show a significant anxiolytic effect （P>0.05）.Cortex Albiziae water extract butanol group and Cortex Albiziae alcohol extract butanol group had clearly anxiolytic effect （P<0.05）； ELISA results showed that water extract of Cortex Albiziae，Cortex Albiziae extract butanol group and Cortex Albiziae alcohol butanol extract could significantly increase the content of GABA in mice，reduce Glu and 5-HT content in brain.Conclusion：Cortex Albiziae has a significant anxiolytic effect on mice.And this mechanism is related with its effects of improving GABA content and reducing Glu and 5-HT content in the brain of mice.The anxiolytic activity site of Cortex Albiziae is the n-butanol fraction.

Key Words Cortex Albiziae； Anxiolytic； Elevated plus maze； Light-dark； N-butanol fraction

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.002

焦慮癥（Anxiety）又稱焦慮性障礙，是一種以焦慮情緒為主要表現(xiàn)的神經(jīng)癥，是以廣泛和持續(xù)發(fā)作性焦慮或反復(fù)發(fā)作性驚恐不安為主要特征的神經(jīng)性障礙，臨床上常伴有頭暈、呼吸困難、心悸、汗出、胸悶、口干、尿急、尿頻和運動不安等[1-5]，隨著工作生活壓力的增大，其發(fā)病率逐年上升。西醫(yī)治療焦慮癥存在著廣泛的不良反應(yīng)，如頭昏、嗜睡、乏力及記憶力減退等[6]，而且容易產(chǎn)生藥物依賴性以及停用藥物后一系列戒斷癥狀[7]，單純的心理治療治愈率也并不高。因此研究開發(fā)安全有效的抗焦慮中藥制劑顯得尤為重要[8]。

合歡皮為豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的樹皮，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性平味甘，歸心、肝、肺經(jīng)。2015版《中華人民共和國藥典》記載了合歡皮具有解郁安神、活血消腫的功效，臨床常用于心神不安、憂郁失眠、肺癰、瘡腫、跌撲傷痛等病癥[9]。藥理研究表明合歡皮一般劑量（10～15 g）可解郁安神，起鎮(zhèn)靜作用[10]，中低劑量合歡皮水煎液可協(xié)同戊巴比妥納縮短睡眠潛伏期及延長睡眠時間（P<0.01），起鎮(zhèn)靜催眠作用[11]。且已有研究表明合歡皮提取物具有一定的抗焦慮作用[12]。本實驗通過觀察合歡皮對焦慮小鼠行為的影響，評價合歡皮的抗焦慮藥效作用并探討其作用機(jī)制，并對合歡皮抗焦慮作用的活性部位進(jìn)行初步篩選，以便為臨床辨證用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 KM小鼠，SPF級，體重（20±2）g，雄性。購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，許可證號：SCXK（豫）2010-0002，質(zhì)量證號：NO.41003100000236。分籠飼養(yǎng)于動物實驗中心，溫度（20±2）℃。

1.1.2 藥物 地西泮片（天津力生制藥股份有限公司，批號：1304006）；合歡皮（鄭州市瑞龍制藥股份有限公司，批號：141202）。

1.1.3 試劑與儀器 氯仿（天津市登科化學(xué)試劑有限公司，AR）；乙酸乙酯（天津市登科化學(xué)試劑有限公司，AR）；正丁醇（天津市登科化學(xué)試劑有限公司，AR）；乙醇（天津市登科化學(xué)試劑有限公司，AR）等；γ-氨基丁酸（GABA）檢測試劑盒（R&D，批號：20131101A）；谷氨酸（Glu）檢測試劑盒（R&D，批號：20131101A）；五羥色胺（5-HT）檢測試劑盒（R&D，批號：20131101A）；PM-100高架十字迷宮視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）、小鼠明暗箱裝置（實驗室自制）、酶免儀（680 Microplate Reader，Bio-Rad Laboratories）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 在合歡皮水提液和醇提液對小鼠抗焦慮作用研究中，選用雄性SPF級小鼠，60只，體重（20±2）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第4天稱重編號，按隨機(jī)分組軟件隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為焦慮模型組，陽性給藥組，合歡皮水提液高、中，低劑量組；在合歡皮對小鼠抗焦慮活性部位篩選的研究中，選用雄性SPF級小鼠，100只，體重（20±2）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第4天稱重編號，按隨機(jī)分組軟件隨機(jī)分為10組，10只/組，分別為焦慮模型組，陽性組，地西泮水溶液組，合歡皮水提液組，合歡皮水提液氯仿萃取物組，合歡皮水提液乙酸乙酯萃取物組，合歡皮水提液正丁醇萃取物組，合歡皮醇提物組，合歡皮醇提物氯仿萃取組，合歡皮醇提物乙酸乙酯萃取組，合歡皮醇提物正丁醇萃取組。

以上實驗，均選用高架十字迷宮（EPM）和明暗箱（LDT）來制備裝置環(huán)境所致的焦慮動物模型。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 藥物的制備 取合歡皮（粗粉）50 g，水提2次，1 h/次，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，將濃縮液平均分為2份，1份作為合歡皮水提物供藥理實驗，另一份依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，所得萃取液減壓濃縮至浸膏，各加水50 mL得合歡皮水提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物藥液，備用；另取合歡皮（粗粉）50 g用95%乙醇回流提取2次，1 h/次，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏并揮至無醇味，取干燥浸膏分成2份，分別加水50 mL，1份作為合歡皮醇提液，另1份依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，所得萃取液減壓濃縮至浸膏，各加水50 mL得合歡皮醇提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物藥液，備用。

1.2.2.2 合歡皮水提液對小鼠的抗焦慮作用研究于每日上午8：30灌胃給藥，給藥體積0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥5 d。焦慮模型組給予蒸餾水；陽性組給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）；合歡皮水提液高、中、低劑量組分別給予（5 g/kg，2.5 g/kg，1.25 g/kg）的合歡皮水提液。

1.2.2.3 合歡皮醇提液對小鼠的抗焦慮作用研究于每日上午8：30灌胃給藥，給藥體積0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥5 d。焦慮模型組給予蒸餾水；陽性組給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）；合歡皮醇提液高、中、低劑量組分別給予（0.0633 g/kg，0.0315 g/kg，0.0153 g/kg）的合歡皮醇提液。

1.2.2.4 合歡皮對小鼠抗焦慮活性部位篩選 于每日上午8：30灌胃給藥，給藥體積0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥5 d。焦慮模型組給予蒸餾水；陽性組給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）；合歡皮水提液組給予合歡皮水提液（2.5 g/kg）；合歡皮水提液氯仿萃取物組給予合歡皮水提液氯仿萃取物（0.024 g/kg）；合歡皮水提液乙酸乙酯萃取物組給予合歡皮水提液乙酸乙酯萃取物（0.025 g/kg）；合歡皮水提液正丁醇萃取物組給予合歡皮水提液正丁醇萃取物（0.11 g/kg）；合歡皮醇提物組給予合歡皮醇提物（0.0315 g/kg）；合歡皮醇提物氯仿萃取組給予合歡皮醇提物氯仿萃取物（0.017 g/kg）；合歡皮醇提物乙酸乙酯萃取組給予合歡皮醇提物乙酸乙酯萃取物（0.084 g/kg）；合歡皮醇提物正丁醇萃取組給予合歡皮醇提物正丁醇萃取物（0.16 g/kg）。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 本實驗選用高架十字迷宮試驗中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比以及明暗箱實驗中的穿箱次數(shù)作為評價藥物抗焦慮作用的指標(biāo)；并用酶聯(lián)免疫吸附法對小鼠腦組織中GABA、Glu和5-HT的含量進(jìn)行測定，以探討其抗焦慮作用的機(jī)制。具體方法如下。

1.2.3.1 高架十字迷宮實驗 灌胃給藥第5天，按日常灌胃順序，每5 min間隔給藥，給藥0.5 h后進(jìn)行高架十字迷宮實驗。實驗前先將小鼠置于開場中活動5 min，然后將小鼠置于迷宮中央，使其頭部正對其中一個開放臂，用計算機(jī)跟蹤記錄小鼠在高架十字迷宮上的活動情況，記錄時間為5 min。以小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OE%）即開臂進(jìn)入次數(shù)/（開臂進(jìn)入次數(shù)+封臂進(jìn)入次數(shù)）和開臂滯留時間百分比（OT%）即開臂滯留時間/（開臂滯留時間+封臂滯留時間）作為評價藥物抗焦慮作用的指標(biāo)[13]。

1.2.3.2 明暗箱實驗 高架十字迷宮實驗結(jié)束后立即進(jìn)行明暗箱實驗，先使其在安靜的環(huán)境下自由活動5 min，然后將小鼠背對暗室置于明室中央，觀察記錄10 min內(nèi)小鼠在明暗箱內(nèi)的穿箱次數(shù)（TT），以此作為評價藥物抗焦慮作用的指標(biāo)。實驗過程中注意保持實驗環(huán)境的安靜和實驗裝置的清潔從而減少外界環(huán)境對實驗結(jié)果的影響[14]。

1.2.3.3 抗焦慮作用機(jī)制研究 小鼠行為學(xué)實驗結(jié)束后，立即斷頭處死，冰臺上迅速剝離全腦，用萬分之一天平精密稱重，以腦組織（g）：生理鹽水（mL）=1∶4的比例加入冰冷的生理鹽水，低溫下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿，勻漿液在4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液置5 mL離心管中，即得濃度為20%的小鼠腦勻漿液，取腦勻漿液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法，分別測定腦組織中GABA、Glu和5-HT的含量[15]，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，組間采用LSD檢驗，最終結(jié)果以（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 合歡皮水提液對小鼠焦慮行為的影響 與焦慮模型組比較，陽性對照組地西泮能增加小鼠高架十字迷宮OE%值（P<0.05）和OT%值（P<0.05），明顯增加小鼠在明暗箱穿箱TT值（P<0.01），表明造模成功。與焦慮模型組比較，合歡皮水提液高劑量組能增加小鼠高架十字迷宮OT%值（P<0.05）；合歡皮水提液中劑量組能顯著增加小鼠高架十字迷宮OT%值（P<0.01）和OE%值（P<0.05）；合歡皮水提液各劑量組均能增加小鼠在明暗箱TT值（P<0.05）。顯示出合歡皮中、高劑量水提液對小鼠的抗焦慮作用，尤其以合歡皮水提液中劑量的抗焦慮作用更為明顯。見表1。

2.2 合歡皮醇提液對小鼠焦慮行為的影響 與焦慮模型組比較，陽性對照地西泮組小鼠高架十字迷宮OE%值和OT%值均有顯著性增加（P<0.05），說明焦慮模型造模成功。與焦慮模型組比較，合歡皮醇提液僅中劑量組能增加小鼠高架十字迷宮OE%值（P<0.05），其余各組在小鼠高架十字迷宮OE%值開、OT%值，及穿箱TT值上均僅顯示出有一定的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3 合歡皮不同部位對焦慮小鼠行為影響

與焦慮模型組比較，陽性對照地西泮組能顯著增加小鼠高架十字迷宮OE%值和OT%值，表明焦慮模型造模成功。

與焦慮模型組比較，合歡皮水提液組、水提乙酸乙酯組、水提正丁醇組、合歡皮醇提物組、合歡皮醇提物正丁醇萃取物組均有顯著性提高小鼠高架十字迷宮OT%值（P<0.05）；水提氯仿萃取組、醇提氯仿萃取組、醇提乙酸乙酯萃取組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

與焦慮模型組比較，合歡皮水提液組、合歡皮水提正丁醇萃取組、合歡皮醇提正丁醇萃取組均有顯著性提高小鼠高架十字迷宮OE%值（P<0.05）；水提氯仿萃取組、水提乙酸乙酯萃取組、合歡皮醇提物組、醇提氯仿萃取組、醇提乙酸乙酯萃取組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

與焦慮模型組比較，僅陽性對照地西泮組能顯著提高穿箱TT值（P<0.05）。

上述結(jié)果提示，合歡皮水提液組、合歡皮水提正丁醇萃取組、合歡皮醇提正丁醇組有一定的抗焦慮作用。見表3。

2.4 合歡皮對焦慮小鼠腦內(nèi)GABA、Glu、5-HT含量的影響 與焦慮模型組比較，陽性對照地西泮組、合歡皮水提液組、合歡皮水提正丁醇部位、合歡皮醇提正丁醇部位均可提高小鼠腦內(nèi)GABA含量，降低小鼠腦內(nèi)Glu含量，降低小鼠腦內(nèi)5-HT含量，其抗焦慮作用機(jī)制可能與其降低小鼠腦內(nèi)Glu、5-HT含量，提高小鼠腦內(nèi)GABA含量有關(guān)。見表4。

3 討論

實驗結(jié)果表明合歡皮水提液（2.5 g/kg）對焦慮小鼠行為有明顯的干預(yù)作用，即合歡皮水提液（2.5 g/kg）有一定的抗焦慮作用。合歡皮的醇提液經(jīng)過多次調(diào)整劑量及多次抗焦慮小鼠行為學(xué)實驗，僅合歡皮醇提液（0.0315 g/kg）表現(xiàn)出較弱的抗焦慮作用。表明合歡皮抗焦慮有效部位主要在水溶性部位。將合歡皮水提液和醇提物分別經(jīng)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將萃取物分別進(jìn)行抗焦慮行為學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)合歡皮水提液正丁醇萃取物及合歡皮醇提物正丁醇萃取物均有較好的抗焦慮作用，即合歡皮抗焦慮的有效部位主要為正丁醇部位。通過對小鼠腦內(nèi)遞質(zhì)含量的測定，發(fā)現(xiàn)其抗焦慮作用與提高小鼠腦內(nèi)GABA含量，降低小鼠腦內(nèi)Glu、5-HT含量有關(guān)。合歡皮的正丁醇部位主要為木酯素類物質(zhì)，有報道表明其木酯素類成分為合歡皮鎮(zhèn)靜安神的主要成分[16]，這與我們的實驗結(jié)果相契合。由此我們可以在已經(jīng)證明正丁醇部位為有效活性部位的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的研究，在分離得到的正丁醇部位可以采用硅膠色譜法將其分離，在分離得到的物質(zhì)上繼續(xù)進(jìn)行抗焦慮行為學(xué)實驗，以便進(jìn)一步明確合歡皮抗焦慮的活性成分。

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