肉豆蔻揮發(fā)油β—CD包合物GC—MS成分分析及其抗抑郁活性物質(zhì)研究

王銳 潘貝 趙華偉 楊淑 牛源菲 崔瑛

摘要 目的：檢測(cè)肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物所含化學(xué)成分，并初步認(rèn)識(shí)肉豆蔻抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：利用GC-MS法對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物進(jìn)行化學(xué)成分檢測(cè)以及對(duì)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組的大鼠血清、大腦進(jìn)行生物樣本分析。結(jié)果：在肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物中共指認(rèn)30種化合物，在慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠的血清中指認(rèn)了α-蒎烯（à-Pinene、á-pinene）、α-水芹烯（α-Phellandrene）、-萜烯（-Terpinene）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、黃樟醚（Safrole）、肉豆蔻醚（Myristicin）、-細(xì)辛醚（-Asarone）共8種化合物，在腦組織中指認(rèn)了α-水芹烯（α-Phellandrene）、o-傘花烯（o-Cymene）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、黃樟醚（Safrole）、肉豆蔻醚（Myristicin）、-細(xì)辛醚（-Asarone）共6種化合物。結(jié)論：肉豆蔻抗抑郁活性可能是多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，其關(guān)鍵活性成分可能為透過(guò)血腦屏障而進(jìn)入腦組織的化學(xué)成分：α-水芹（α-Phellandrene）、o-傘花烯（o-Cymene）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、黃樟醚（Safrole）、肉豆蔻（Myristicin）、-細(xì)辛醚（-Asarone）。

關(guān)鍵詞 肉豆蔻；β-CD包合物；成分；抗抑郁；活性物質(zhì)

Abstract Objective：To determine the chemical constituents of volatile oil from Semen Myristicae，and preliminarily recognize the material basis of antidepressant effect of Semen Myristicae.Methods：GC-MS method was used to analyze the chemical components of volatile oil from Semen Myristicae and serum and brain samples of the chronic unpredictable mild stress model administration group rats.Results：A total of 30 compounds were identified in the volatile oil of Semen Myristicae，and 8 compounds were identified in the serum in model administration group rats including á-pinene，α-Phellandrene，-Asarone，Terpinen-4-ol，Safrole，Myristicin C-Asarone.6 compounds including α-Phellandrene，o-Cymene，Terpinen-4-ol，Safrole，Myristicin，-Asarone were detected in brain tissue.Conclusion：The antidepressant activity of Semen Myristicae may be the combined effects of a variety of substances，and chemical composition of the key active ingredient may be through the blood-brain barrier into brain tissue：alpha-Phellandrene，o-Cymene，Terpinen-4-ol，Safrole，Myristicin，C-Asarone.

Key Words Semen Myristicae； Essential oil； Antidepressant； Active substance

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.001

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻Mgristica fragrans Houtt的干燥成熟種仁[1]。始載于《藥性論》?！端幮哉摗吩啤澳苤餍和履妫幌氯?，腹痛，治宿食不消，痰飲”。《開(kāi)寶本草》又云：“主鬼氣”。其味辛性溫，入脾、胃、大腸經(jīng)，能溫中行氣、澀腸止瀉，用于脾胃虛寒，久瀉不止，脘腹脹痛，食少嘔吐[1]。肉豆蔻中的揮發(fā)油、脂肪油、苯丙素類、木脂素類和肉豆蔻醚等是其主要化學(xué)成分[2-3]。其揮發(fā)油的主要成分為肉豆蔻醚（Myristicn），細(xì)辛醚（Asarone），丁香酚（Eugenol），甲基丁香酚（Methyleugenol），順式甲基異丁香酚（Cis-methyl isoeugenol），異欖香脂素（Isoelemicin）等[4-7]。肉豆蔻具有非常廣泛的藥理作用，如止瀉、保肝、抗菌、抗炎、抗氧化、防癌、提高心臟耐氧、抗心肌缺血等[8]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，肉豆蔻揮發(fā)油不僅具有一定的中樞神經(jīng)興奮作用，還有一定的中樞抑制作用。其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用主要是由于肉豆蔻具有增強(qiáng)5-羥色胺作用和具有中等強(qiáng)度的單胺氧化酶抑制作用[8]；中樞神經(jīng)抑制作用方面，韓蕾等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)肉豆蔻揮發(fā)油具有一定的催眠協(xié)同和抗驚厥作用。

抑郁癥是一種較常見(jiàn)的心理精神疾病，又稱為抑郁障礙，不僅表現(xiàn)出一定的心理癥狀還常常伴隨著軀體癥狀，使患者受到心理和身體上的雙重傷害。目前認(rèn)為抑郁證的發(fā)病原因有很多，大多認(rèn)為社會(huì)環(huán)境、個(gè)人心理及生物等其他諸多因素相互作用而導(dǎo)致的，但具體的發(fā)病機(jī)制仍停留的假說(shuō)階段。

肉豆蔻揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、遇熱易分解，嚴(yán)重影響以揮發(fā)油為原料的肉豆蔻抗抑郁制劑的穩(wěn)定性。為了保證肉豆蔻揮發(fā)油的產(chǎn)品的穩(wěn)定性，更好的發(fā)揮藥物的療效我們運(yùn)用β-環(huán)糊精（β-CD）對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油進(jìn)行包合，初步研究肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型大鼠抗抑郁作用的相關(guān)活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠SPF級(jí)，體重（200±20）g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0004，批號(hào)：41003100002736，飼養(yǎng)于動(dòng)物房大鼠IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具內(nèi)，溫度（25±2）℃，并由專人負(fù)責(zé)；飼料購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-005，批號(hào)：41000100002351。

1.1.2 藥物 肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物實(shí)驗(yàn)室自制，含油量為12.3%；氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：7B14112104）；鹽酸氟西?。ǔＶ菔兴乃幹扑幱邢薰?，批號(hào)：201410101）。

1.1.3 試劑與儀器 無(wú)水乙醚（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，AR）；無(wú)水硫酸鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，AR）；JJ-1000電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠Acculab；電子天平：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；賽默飛TSQ8000Evo三重串聯(lián)四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)賽默飛儀器公司；附溫比重瓶：安徽省鳳陽(yáng)縣玻璃廠；OFT-100大小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；大鼠IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，第6天稱重并標(biāo)記，隨機(jī)分為4組，10只/組，分別為空白組，模型組，鹽酸氯米帕明（0.05 g/kg）組，模型給藥組（20.00 g/kg）。建立慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁大鼠模型（CUMS）：空白組正常飼養(yǎng)，不給予任何刺激。其他各組大鼠單籠飼養(yǎng)，并施予應(yīng)激：明暗顛倒，24 h禁水，24 h傾斜鼠籠，24 h禁食，潮濕飼養(yǎng)（24 h），45 ℃熱水游泳（5 min），夾尾（5 min），4 ℃冰水游泳（5 min），超聲刺激（40 KHz·1 h）。每日隨機(jī)一種刺激，持續(xù)21 d[9]。

1.2.2 給藥方法 空白組和模型組灌胃給予飲用水，鹽酸氯米帕明組灌胃給予0.05 g/kg的鹽酸氯米帕明混懸液，模型給藥組灌胃給予20.00 g/kg的肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物混懸液。上午9：00灌胃給藥，按2 mL/100 g的給藥體積連續(xù)給藥21 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

肉豆蔻揮發(fā)油GC-MS法化學(xué)成分分析：精密量取肉豆蔻揮發(fā)油0.1 mL，加入到潔凈干燥的10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醚定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，采用GC-MS色譜條件[10-14]進(jìn)行分析，色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管（30 m×250 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；分流比：60∶1；流速：0.8 mL/min；程序升溫：40 ℃保持2 min，以60 ℃/min速度升溫到230 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至280 ℃保持5 min；離子源溫度：230 ℃；傳送線230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；掃描質(zhì)量范圍：20～500 amu；載氣：高純氦氣；進(jìn)樣量：肉豆蔻揮發(fā)油進(jìn)樣量為0.5 μL。

敞箱實(shí)驗(yàn)：按照各劑量組給藥60 min后，利用OFT-100大小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠置于敞箱（長(zhǎng)×寬：50 cm×50 cm）的中間，計(jì)時(shí)5 min，記錄其在敞箱內(nèi)運(yùn)動(dòng)的距離（mm）及站立次數(shù)。徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下1只大鼠的觀察。敞箱實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)距離的減少反映了大鼠的自主活動(dòng)度降低，站立次數(shù)的減少反映了動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的探索程度降低，故使用運(yùn)動(dòng)距離與站立次數(shù)兩項(xiàng)治療來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物在新異環(huán)境中的自主行為與探究行為。

大鼠腦組織及血清中肉豆蔻揮發(fā)油GC-MS法成分分析：各取3只空白組大鼠、模型給藥組大鼠，在敞箱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘眼球取血，取血結(jié)束后，脫頸椎處死大鼠并斷頭，在冰臺(tái)上迅速剝離全腦，用生理鹽水處理干凈，吸水紙吸干，精密稱重，并立即用液氮冷凍，錫紙包裹，放置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。臨用前將腦組織從-80 ℃冰箱取出，冰臺(tái)上解凍，解凍后1 g腦組織加入生理鹽水3 mL，用組織研磨器在冰浴條件下將其制備成勻漿液；并在4 ℃，10 000 r/min條件下高速離心5 min，仔細(xì)收集上清液并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，即是大鼠腦組織勻漿液，精密吸取0.5 mL勻漿液置10 mL離心管中，加入2 mL氯仿，以2 000 r/min渦旋震蕩5 min，然后再次在4 ℃，10 000 r/min條件下離心5 min后，取出氯仿層，氮?dú)獯蹈蓛x吹干，吹干后加入2 mL無(wú)水乙醚，充分振搖，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾[15]。全血在4 ℃溫度下，以8 000 r/min離心10 min后，精密吸取0.5 mL血清置10 mL離心管中，加入2 mL氯仿，以2 000 r/min渦旋震蕩5 min，然后再次在4 ℃，8 000 r/min條件下離心5 min后，取出氯仿層，氮?dú)獯蹈蓛x吹干，吹干后加入2 mL無(wú)水乙醚，充分振搖，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。采用GC-MS色譜條件進(jìn)行分析，GC-MS色譜條件同上。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油進(jìn)行氣象質(zhì)譜分析，所得圖譜經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理，并經(jīng)過(guò)Xcalibur軟件數(shù)據(jù)庫(kù)分析，并用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)百分含量。

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，組間采用LSD檢驗(yàn)，最終結(jié)果以（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉豆蔻揮發(fā)油GC-MS法化學(xué)成分分析結(jié)果 對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油進(jìn)行氣象質(zhì)譜分析，所得圖譜經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理，并經(jīng)過(guò)Xcalibur軟件數(shù)據(jù)庫(kù)分析，并用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)百分含量，所得結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

由圖1、表1可知，GC-MS法共指認(rèn)了肉豆蔻揮發(fā)油中30種化合物，相對(duì)百分含量在1.00%以上的化合物有14種，其中α-水芹烯（α-Phellandrene）的相對(duì)百分含量最高，為40.19%，其次為α-蒎烯（Pinene），其百分含量為17.81%。另外肉豆蔻醚（Myristicin）的相對(duì)含量為4.84%，黃樟醚的相對(duì)含量為1.65%。通過(guò)對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油部分物理常數(shù)的測(cè)定和化學(xué)成分的分析，可以為肉豆蔻揮發(fā)油的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定一定基礎(chǔ)，提供一定的參考價(jià)值。

2.2 肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物對(duì)CUMS大鼠體重的影響 表2可以看出，與空白組比較，模型組大鼠的體重顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸氟西汀組、模型給藥組能夠顯著改善大鼠體重降低程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 肉豆蔻揮發(fā)油β-CD包合物對(duì)CUMS大鼠行為學(xué)的影響 由表3可以看出，與空白組比較，模型組大鼠的運(yùn)動(dòng)距離顯著縮短（P<0.01），站立次數(shù)顯著減少（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性藥鹽酸氟西汀組能延長(zhǎng)大鼠運(yùn)動(dòng)距離，顯著改善大鼠自主活動(dòng)狀況，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）并且有增加大鼠站立次數(shù)，提高大鼠對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，模型給藥組均能夠延長(zhǎng)大鼠運(yùn)動(dòng)距離，顯著改善大鼠自主活動(dòng)狀況，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠血清中揮發(fā)油成分分析 圖2圖譜經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理，并經(jīng)過(guò)Xcalibur軟件數(shù)據(jù)庫(kù)分析，并與肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分（圖1）比較，在慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠的血清中指認(rèn)了α-蒎烯（à-Pinene、á-pinene）、α-水芹烯（α-Phellandrene）、-萜烯（-Terpinene）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、黃樟醚（Safrole）、肉豆蔻醚（Myristicin）、-細(xì)辛醚（-Asarone）共8種化合物。見(jiàn)表4。

2.5 慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠大腦組織中揮發(fā)油成分分析 圖3圖譜經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理，并經(jīng)過(guò)Xcalibur軟件數(shù)據(jù)庫(kù)分析，并與肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分（圖1）比較，在慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠的腦組織中指認(rèn)了α-水芹烯（α-Phellandrene）、o-傘花烯（o-Cymene）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、黃樟醚（Safrole）、肉豆蔻醚（Myristicin）、-細(xì)辛醚（-Asarone）共6種化合物。見(jiàn)表5。

由上述結(jié)果可知，在慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠的血清中和腦組織中含有的揮發(fā)油成分不盡相同，說(shuō)明肉豆蔻揮發(fā)油發(fā)揮抗抑郁作用是多種化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果。

3 討論

肉豆蔻具有抗抑郁藥理作用必然以一定的化學(xué)物質(zhì)為基礎(chǔ)。肉豆蔻揮發(fā)油含有許多化學(xué)物質(zhì)，要想進(jìn)一步認(rèn)知它，需要以一定的病證模型為基礎(chǔ)，將藥理活性的觀察與動(dòng)物體內(nèi)肉豆蔻物質(zhì)的分析檢測(cè)結(jié)合起來(lái)，從而獲得肉豆蔻抗抑郁活性物質(zhì)的認(rèn)識(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了采用氣質(zhì)聯(lián)用分析測(cè)試方法對(duì)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型給藥組大鼠的血清及腦組織中進(jìn)行化學(xué)成分分析，來(lái)認(rèn)識(shí)肉豆蔻揮發(fā)油的抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。文獻(xiàn)研究證明[7，16]肉豆蔻醚既是有效成分又是毒性成分，能透過(guò)血腦屏障，對(duì)中樞有興奮作用，能夠抑制單胺氧化酶活性且增加5-HT作用，這與我們的研究結(jié)果基本一致。

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