不同花色苷代表性成分的 分離鑒定及體外抗氧化活性的研究

高 品,呂曉玲,王璐瑤,王艷麗,王建新,鄭滿榮

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

花青素類(lèi)物質(zhì)為重要的水溶性植物色素,屬于酚類(lèi)化合物中的類(lèi)黃酮,廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中?；ㄉ疹?lèi)色素對(duì)大量植物及其制品的色澤起著主要作用,并且具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗[1]、抗突變及抗腫瘤等生物活性[2]。因此,國(guó)內(nèi)外各種植物花色苷提取物被廣泛作為食用色素和功能性配料用于食品和保健食品[3]。但由于花色苷多以混合物存在,不同來(lái)源的提取物中花色苷的組成差異較大,對(duì)其選擇性的應(yīng)用造成一定限制[4]。

由于植物花色苷的不穩(wěn)定性及含量相對(duì)較低,傳統(tǒng)分離花色苷多為硅膠柱色譜、凝膠色譜、紙色譜、C18反相色譜等方法[5],存在制備量小、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn),難以獲得大量高純度花色苷,是進(jìn)一步研究的瓶頸。高速逆流色譜(HSCCC)是一種不使用吸附劑的液-液分配色譜技術(shù),具有高效、穩(wěn)定、制備量大的特點(diǎn),被廣泛用于天然活性成分的制備分離,也成功用于葡萄皮[6]、紫甘藍(lán)等植物中的花色苷分離和制備[7]。本文采用高速逆流色譜分離不同來(lái)源花色苷的代表性單體化合物,并比較了其體外抗氧化活性,為花色苷提取物的產(chǎn)品質(zhì)量控制及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫甘薯花色苷(花色苷含量18.53%) 葫蘆島茂華生物有限責(zé)任公司;黑加侖花色苷(花色苷含量28.73%),桑葚花色苷(花色苷含量25.70%) 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司;黑枸杞花色苷 根據(jù)文獻(xiàn)[8]提取純化,測(cè)得花色苷含量14.62%;乙腈:色譜純,甲基叔丁基醚,正丁醇:分析純;超純水 Milli-Q超純水機(jī)制得。

LC-20高效液相色譜儀 日本島津公司;高速逆流色譜儀TBE300C 上海同田生物技術(shù)股份有限公司;離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜(LCMS-IT-TOF) 日本島津公司;半制備高效液相色譜儀 日本島津公司;MODULYOD-230 冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific;UV-2101 PCS 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC分析條件 ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);紫甘薯花色苷和黑枸杞花色苷液相分析條件在陸英[9]等人的條件下經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)為:流動(dòng)相:A:0.2%磷酸水,B:乙腈,二元梯度洗脫:0～30 min,15%～25% B;黑加侖花色苷與桑葚花色苷的液相分析條件在鄒堂斌[10]等人的條件下經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)為:流動(dòng)相:A:10%甲酸水,B:乙腈,二元梯度洗脫:0 min 5% B,15 min 15% B,21 min 28% B,22 min 40% B,24 min 60% B,27 min 5% B,30 min 5% B;流速1 mL/min,柱溫30 ℃。

1.2.2 HSCCC溶劑體系的選擇 在50 mL離心管里將不同溶劑按比例配置上下相,充分混合后分層,分別取4 mL上相和下相,分別裝入另外兩個(gè)干凈的10 mL離心管中。將少量的花青素粗提物加入下相,溶解后取1 mL,用HPLC檢測(cè),記為C1。在剩余的含有花青素的下相中加入3 mL的上相。充分混合后再取1 mL下相,用HPLC檢測(cè),含量記為C2。

根據(jù)K值選擇合適的溶劑體系作為HSCCC的固定相和流動(dòng)相。

1.2.3 HSCCC制備分離花色苷單體 按照甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈∶水∶三氟乙酸(V/V,紫甘薯花色苷:2∶5∶1∶6∶0.01,黑枸杞花色苷:2.5∶1.5∶1∶5∶0.01,黑加侖花色苷和桑葚花色苷:2∶2∶1∶5∶0.01)配置溶劑體系,置于分液漏斗中,充分振蕩2～3次,靜置至上下相分層明顯,將上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相,超聲脫氣30 min備用。將固定相以30 mL/min的流速泵入HSCCC管路中,待固定相充滿管路后,以850 r/min正接正轉(zhuǎn),將流動(dòng)相以5 mL/min的流速泵入,檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm,待有下相流出一段時(shí)間后體系達(dá)到平衡,將200 mg樣品以15 mL下相溶解后進(jìn)樣,根據(jù)HSCCC色譜圖對(duì)出峰位置進(jìn)行收集,獲得高純度花色苷單體。

1.2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源ESI;正離子掃描模式;干燥氣溫度350 ℃;氮?dú)饬魉?1.5 L/min;干燥器壓力133.0 KPa;噴射電壓:4 KV;掃描一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜。

1.2.5 體外抗氧化性的研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)中的方法[12],分別向試管中加入2.0 mL 0.1 mmol/mL的DPPH乙醇溶液及2.0 mL的不同濃度的花色苷溶液,混勻,室溫下避光放置30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合物的吸光度。

清除率SD(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

其中:Ac:2 mL DPPH加2 mL無(wú)水乙醇;Aj:2 mL無(wú)水乙醇加2 mL待測(cè)液;Ai:2 mL DPPH加2 mL待測(cè)液。

1.2.5.2 總還原力的測(cè)定 參考Bae的方法[13],于試管中加入1.0 mL樣品溶液,1.0 mL磷酸鈉緩沖液(0.2 M,pH6.6)和1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL,充分混合。50 ℃恒溫水浴20 min后,加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL,搖勻,取2.5 mL上層清液用2.5 mL水稀釋一倍,加入0.1%氯化鐵溶液0.5 mL,靜置10 min,測(cè)定混合液在700 nm處吸光值。還原力表示成混合液在700 nm處的吸光值。

1.2.5.3 羥自由基清除能力的測(cè)定 按照Smirnoff的方法[14],反應(yīng)體系中含8.8 mmol/L H2O21 mL,10 mmol/L FeSO41 mL,10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL,分別加入不同濃度花色苷溶液1 mL。最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37 ℃反應(yīng)0.5 h,以蒸餾水作參比,在510 nm下測(cè)定各濃度的吸光度?？紤]花色苷本身的吸光值,以10 mmol/L FeSO41 mL,10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL,不同濃度花色苷溶液1 mL和1 mL蒸餾水作為花色苷空白。

清除率計(jì)算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中:A0為對(duì)照液的吸光度;A1為加入花色苷溶液后的吸光度;A2為不加顯色劑H2O2花色苷溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS(Statistical Product and Sercice Solution)22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Origin 8.0作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析

2 結(jié)果與分析

2.1 四種花色苷提取物的液相色譜圖及主要組分

四種花色苷提取物的液相色譜圖如圖1～圖4所示。

圖1 紫甘薯花色苷的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC diagram of anthocyanin in purple sweet potato

圖2 黑枸杞花色苷的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC diagram of anthocyanin in Lycium ruthenicum Murr

圖3 黑加侖花色苷的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC diagram of anthocyanin in blackcurrant

圖4 桑葚花色苷的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC diagram of anthocyanin in mulberry

由圖1～圖4可知,紫甘薯花色苷主要含四種組分,組分1占19.08%,組分2占15.41%,組分3占14.12%,組分4占32.10%,其含量最高的為組分4;黑枸杞花色苷主要含三種組分,組分1占13.36%,組分2占4.43%,組分3占71.60%,其主要成分為組分3;黑加侖花色苷主要含四種組分,組分1占12.51%,組分2占30.50%,組分3占12.93%,組分4占30.68%,其主要成分為組分4;桑葚花色苷含兩種組分,組分1占53.91%,組分2占29.64%,其主要成分為組分1。

2.2 HSCCC溶劑體系的選擇

要使溶劑體系兩相間能快速明顯地分層,要求體系與被分離物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng),且樣品能在溶劑體系中很好的溶解;使其在兩相間的分配系數(shù)K在0.5～2之間,且樣品中不同化合物的分配系數(shù)比大于1.5。有較高的固定相保留值(不小于40%),這樣快速能夠保證有效的分離。針對(duì)不同樣品,對(duì)不同配比的溶劑體系進(jìn)行篩選,結(jié)果見(jiàn)表1～表4。

表1 不同溶劑體系的分配系數(shù)(紫甘薯花色苷)Table 1 Partition coefficient(K)of compounds in different solvent systems(Purple sweet potato anthocyanins)

表2 不同溶劑體系的分配系數(shù)(黑枸杞花色苷)Table 2 Partition coefficient(K)of compounds in different solvent systems(Anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr.)

表3 不同溶劑體系的分配系數(shù)(黑加侖花色苷) Tab. 3 Partition coefficient(K)of compounds in different solvent systems(Black currant anthocyanins)

表4 不同溶劑體系的分配系數(shù)(桑葚花色苷)Table 4 Partition coefficient(K)of compounds in different solvent systems(Mulberry anthocyanins)

由表1可知,第1、3、5溶劑體系中,被分離組分的分配系數(shù)超過(guò)2,在第2、4溶劑體系中,組分1的分配系數(shù)過(guò)小,不能很好的分離,編號(hào)6溶劑體系分配系數(shù)K在合適范圍內(nèi),優(yōu)于其他體系,有良好的分離度,且樣品中不同化合物的分配系數(shù)比較大,故選擇編號(hào)6,即2∶5∶1∶6∶0.01的溶劑體系進(jìn)行紫甘薯花色苷的分離。

由表2可知,組分1在不同溶劑體系中K值都較小,無(wú)法分離出單體物質(zhì),但組分3能與組分1和組分2良好的分離,其中,第2種溶劑體系得到的不同組分間K值的比值更大,故選擇2∶2∶1∶5∶0.01的溶劑體系進(jìn)行黑枸杞花色苷的分離。

由表3可知,溶劑體系1、2、3中,不同組分的分配系數(shù)比小于1.5,溶劑體系4中不同組分間的分配系數(shù)比值較大,能更好的分離,因此,選擇2∶2∶1∶5∶0.01的溶劑體系進(jìn)行黑加侖花色苷的分離。

由表4可知,溶劑體系1中,兩組分分配系數(shù)的比值小于1.5,因此,選擇2∶2∶1∶5∶0.01的體系進(jìn)行桑葚花色苷的分離。

2.3 HSCCC制備分離四種不同花色苷的單體

2.3.1 四種不同花色苷的單體分離制備 采用選出的分離不同花色苷的最優(yōu)溶劑體系,根據(jù)出峰位置收集得到不同組分,分別在40 ℃下旋蒸,凍干保存。

2.3.2 花色苷單體的結(jié)構(gòu)鑒定 采用液質(zhì)聯(lián)用在正離子模式下對(duì)各組分進(jìn)行鑒定,進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜分析,通過(guò)各成分的色譜保留時(shí)間、紫外最大吸收波長(zhǎng)并結(jié)合各成分質(zhì)譜的分子離子峰和碎片離子峰與Truong V D等[15-21]的鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證,數(shù)據(jù)見(jiàn)表5～表8。

表5 紫甘薯花色苷單體的結(jié)構(gòu)鑒定Table 5 Structural identification of anthocyanin monomers from purple sweet potato

表6 黑枸杞花色苷單體的結(jié)構(gòu)鑒定Table 6 Structural identification of anthocyanin in Lycium ruthenicum Murr.

表7 黑加侖花色苷單體的結(jié)構(gòu)鑒定Table 7 Structural identification of anthocyanin monomers of blackcurrant

表8 桑葚花色苷單體的結(jié)構(gòu)鑒定Table 8 Structural identification of the mulberry anthocyanin monomer

2.3.3 四種提取物代表性花色苷單體的選擇 依據(jù)每種花色苷提取物選擇含量較高,分子量較居中的單體化合物作為代表成分的原則,紫甘薯花色苷選擇組分4(芍藥素-3-咖啡酰-阿魏酰槐糖苷-5-葡萄糖苷),黑枸杞選擇組分3(矮牽牛素-3-O-對(duì)香豆酰蕓香糖苷-5-O葡萄糖苷),黑加侖選擇組分4(矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷),桑葚選擇組分1(矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷)作為代表性成分,用HSCCC制備以上四種代表性單體化合物,用液相色譜面積歸一法測(cè)得四種單體組分純度均較高,依次為90.51%、94.25%、95.02%和98.2%。作為后續(xù)研究的材料。

2.4 四種代表性花色苷單體的體外抗氧化性質(zhì)的比較研究

2.4.1 四種代表性花色苷單體DPPH自由基清除能力 DPPH·稱(chēng)二苯代苦味?；杂苫?2,2-diphenyl-l-picry-hydrazyl radical)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,通過(guò)吸光度的減少量可測(cè)定自由基清除劑的清除能力[22]。

四種代表性花色苷單體DPPH自由基清除能力如圖5所示。

圖5 四種不同來(lái)源花色苷單體 DPPH自由基清除能力的比較Fig.5 Comparison of DPPH free radical scavenging ability of four different source anthocyanins

半抑制濃度(即IC50,是清除率達(dá)一半時(shí)樣品的濃度)能較好地反映和比較樣品的抗氧化能力。用SPSS分析軟件計(jì)算出抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度IC50值為14.38 μg/mL,而四種花色苷單體的IC50值均低于抗壞血酸,其中,紫甘薯單體的IC50為6.58 μg/mL,黑枸杞單體的IC50為5.35 μg/mL,黑加侖單體的IC50為4.71 μg/mL,桑葚單體組分的IC50為2.44 μg/mL,由以上數(shù)據(jù)可知,五種抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除能力大小依次為:桑葚>黑加侖>黑枸杞>紫甘薯>VC。

2.4.2 四種代表性花色苷單體的羥自由基清除能力 在眾多自由基中,羥基自由基是最活潑的,反應(yīng)速度較快的,對(duì)機(jī)體危害最大的自由基[23]。四種代表性花色苷單體的羥自由基清除能力如圖6所示。

圖6 四種不同來(lái)源花色苷單體羥自由基清除能力的比較Fig.6 Comparison of hydroxyradical scavenging ability of anthocyanins from four different sources

用SPSS分析軟件計(jì)算出抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度IC50值為228.00 μg/mL,紫甘薯單體化合物對(duì)OH·清除率其IC50為93.32 μg/mL,黑枸杞單體的IC50為123.25 μg/mL,黑加侖單體的IC50為147.37 μg/mL,桑葚單體組分的IC50為95.02 μg/mL,VC的IC50為228.00 μg/mL,由以上數(shù)據(jù)可知,五種抗氧化劑對(duì)OH·自由基清除能力大小依次為:紫甘薯>桑葚>黑枸杞>黑加侖>VC。

2.4.3 四種代表性花色苷單體的還原能力 還原力的測(cè)定以樣品是否為良好的電子供應(yīng)體為指標(biāo),還原力大的樣品是良好的電子供應(yīng)者,供應(yīng)的電子除了可使Fe3+還原為Fe2+外,亦可與自由基反應(yīng),使自由基成為穩(wěn)定的物質(zhì)[24]。

如圖7所示,四種花色苷單體的還原力小于抗壞血酸,是因?yàn)榭箟难?-OH存在稀醇式互變異構(gòu),容易脫氫,因此抗壞血酸還原力大于花色苷。在四種花色苷中,單體還原能力依次為:黑枸杞>桑葚>紫甘薯>黑加侖。

圖7 四種不同來(lái)源花色苷還原能力的比較Fig.7 Comparison of anthocyanin reduction ability in four different sources

3 結(jié)論

通過(guò)高速逆流色譜,選用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水體系分別制備得到紫甘薯、黑枸杞、黑加侖、桑葚花色苷的代表性花色苷單體化合物,用HPLC-MS鑒定推測(cè)為芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-對(duì)香豆酰蕓香糖苷-5-O葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷、矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷,且純度都在90%以上。通過(guò)測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除能力、對(duì)OH·自由基的清除能力以及總還原能力的比較,可以看出不同花色苷單體化合物均具有較好的體外抗氧化性,對(duì)DPPH自由基清除能力大小依次為:桑葚>黑加侖>黑枸杞>紫甘薯>VC,對(duì)OH·自由基清除能力大小依次為:紫甘薯>桑葚>黑枸杞>黑加侖>VC,得出的結(jié)果不一致,可能是由于不同抗氧化指標(biāo)所依賴的物質(zhì)基礎(chǔ)有較大的差異,表明在評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化特性時(shí),指標(biāo)選擇的不同會(huì)造成不相同的結(jié)果。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步從分子或者細(xì)胞水平探究花色苷抗氧化能力,提供更可靠的理論依據(jù);繼續(xù)研究對(duì)比不同花色苷單體其他特性,探究不同花色苷單體的作用機(jī)制。