運用高通量測序技術(shù)分析人參不同栽培模式根際土壤微生物多樣性1)

盧寶慧 高成林 趙玥 劉晨陽 楊鶴

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118) (人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)))

唐玲玲 許永華

(吉林省電力醫(yī)院) (人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)))

人參(PanaxginsengC. A. Mey.)為五加科多年生草本植物，按照其生長環(huán)境可為分為栽培人參和野山參，栽培人參可以分為林下護育人參、采伐基地栽培人參和農(nóng)田栽培人參。野山參經(jīng)過開放式采挖已瀕臨滅絕，而林下護育作為仿生栽培模式，該模式栽培的人參與野山參外形相似，有效成分相近[1]，品質(zhì)優(yōu)于其他兩種栽培模式人參。采伐跡地栽培人參是利用采伐后不久而尚未長起新林的土地栽培的人參，這種方式栽培的人參病害較少，參根的質(zhì)量較好，產(chǎn)量也偏高。由于該模式需要伐林后栽培，可利用的土地資源較少。因此，農(nóng)田栽培人參是我國目前主要的栽培模式。農(nóng)田模式主要是對農(nóng)田土壤改良后進行人參栽培。農(nóng)田栽參土壤改良方法是近年來的研究重點[2-5]。但是，由于各人參栽培地區(qū)的土壤性質(zhì)不同，加上人參的連作障礙的影響[6]，尤其是老參地土壤，土壤改良效果并不理想。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的成分[7]，可通過微生物活動改善土壤理化性質(zhì)、調(diào)節(jié)土壤營養(yǎng)[8-11]。同時，土壤微生物直接參與物質(zhì)的循環(huán)代謝，間接影響植物生長發(fā)育。植物根際微生物多樣性在緩解干旱和鹽堿脅迫對植物生理的影響起著重要作用[12-13]。本研究嘗試采用高通量測序技術(shù)，對林下護育、采伐跡地栽培和農(nóng)田栽培的人參根際土壤中細菌和真菌的多樣性進行研究，分析不同栽培模式的人參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和分布差異，找到林下護育和采伐跡地栽培模式的優(yōu)勢微生物種群分布，為農(nóng)田栽參土壤微生物群落定向改良提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2018年6月，對集安市3種人參栽培模式(林下護育、采伐跡地栽培和農(nóng)田栽培)進行土樣采集。集安地區(qū)主要為紅松(Pinuskoraiensis)、柞樹(Quercusmongolica)、楊樹(PopulusL.)為主的針闊混交林，林齡15～30 a。林下護育模式，采用仿生手段，參籽漫撒林間，人參生長期間不進行人工干預(yù)。采伐跡地栽培模式，林木采伐后將樹根刨出，深翻后構(gòu)建參床，移栽人參，參床上搭拱棚，覆遮陽網(wǎng)和藍色參膜，人參生長期間隨季節(jié)噴施多抗霉素、多菌靈等殺菌劑，若有蟲害或爛根，將腐爛人參起出后，參床表面小面積淋撒生石灰消毒。農(nóng)田栽培人參，前茬為玉米，停耕后深翻，利用威百畝進行土壤熏蒸消毒，待土壤中消殺成分揮發(fā)或分解完畢后起參床，進行人參播種或移栽，田間處理方式同采伐跡地栽培模式。

林下護育模式采樣點(JA.1)：海拔為589 m，地理坐標為(41°7′51″N，126°5′36″E)。

采伐跡地栽培模式采樣點(JA.2)：海拔為567 m，地理坐標為(41°8′30″N，125°47′25″E)。

農(nóng)田栽培模式采樣點(JA.3)：海拔為553 m，地理坐標為(40°53′57″N，125°13′56″E)。

各采樣點的土壤為棕壤，土壤中性或微酸性，土壤礦物風(fēng)化度不高，鹽基接近飽和；氣候條件為半大陸海洋季風(fēng)氣候，年降水量在400～800 mm，無霜期150 d左右。樣品采集時，避免降水天氣，土壤處于自然干燥狀態(tài)。在每個地點用取土器采集人參耕層根際土壤各5份，過10目篩。除去石頭、蟲體、草枝等雜物后，多點土壤樣品充分混合，采用四分法留取土樣。處理后的樣品立刻用液氮處理，隨即使用干冰保存，運輸至實驗室，-80 ℃冷凍保存，用于土壤微生物多樣性分析。

1.2 試驗方法與數(shù)據(jù)處理

實驗材料委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序。采用Usearch(V7.1)軟件進行數(shù)據(jù)處理，物種比對注釋使用RDP classifier軟件，保留置信區(qū)間大于0.8的注釋結(jié)果。利用Mothur軟件在各分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算可觀測物種數(shù)(Observed-otus)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)-威納(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù))，用以進行樣本復(fù)雜度分析，即阿爾法(Alpha)多樣性分析使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線和等級聚類(Rank abundance)曲線。計算樣本間距離并使用不加權(quán)類平均法(UPGMA)構(gòu)建樣本聚類樹，以分析樣本間差異，即貝塔(Beta)多樣性分析。樣本間距離是衡量樣本間的相異系數(shù)，其值越小，表示這兩個樣本在物種多樣性方面存在的差異越小。使用IBM SPSS Statistics 24.0軟件，在P<0.05水平上分析數(shù)據(jù)差異性。

試驗中PCR擴增通用引物為：

(1)細菌V3+V4區(qū)域引物包括上游引物5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和下游引物5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′；

(2)真菌ITS2區(qū)域引物包括上游引物5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′和下游引物5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參根際土壤OTU聚類分析及稀釋曲線

為研究各樣本的物種組成，對所有樣本的有效序列以97%的一致性進行OTUs聚類，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋，每個分類單元即為一個OTU。由表1可知，3種栽培模式(林下護育、采伐跡地栽培和農(nóng)田栽培)土壤樣品經(jīng)高通量測序后，分別得到總DNA的16S rRNA 83 418、74 552、56 105條優(yōu)質(zhì)序列，經(jīng)質(zhì)控、拼接后得到有效序列78 333、70 790、53 549條。平均長度分別為422、417和416 bp，與16S rRNA V3+V4區(qū)序列長度大致吻合，97%的相似水平下聚類分析得到1 965個OTUs。真菌ITS rDNA分別得到優(yōu)質(zhì)序列61 525、62 766、85 791條，有效序列58 541、60 653、81 932條。平均長度分別為303、306、303 bp，97%的相似水平下聚類分析得到468個OTUs。

由圖1、圖2可知，OTU數(shù)目隨著測序數(shù)量的增加而增加，曲線呈逐漸上升后趨于平緩的趨勢。在測序序列>30 000時，細菌、真菌曲線均進入飽和狀態(tài)，即測序量足以覆蓋土壤樣品的細菌、真菌類群。本研究測序數(shù)據(jù)量合理，可具體反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)等信息。

表1 人參根際土壤樣品測序的tags信息及OTU統(tǒng)計分析

圖1 人參根際土壤樣品細菌測序的稀釋曲線

圖2 人參根際土壤樣品真菌測序的稀釋曲線

2.2 人參根際土壤中細菌、真菌群落在綱水平上的分布情況

由表2可知，人參根際土壤中細菌主要分布于以下10個綱：γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、酸性細菌綱(Acidobacteriia)、芽單胞菌綱(unidentified_Gemmatimonadetes)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、放線菌綱(unidentified_Actinobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)、酸桿菌綱(unidentified_Acidobacteria)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)，其中γ-變形菌綱細菌最為豐富，在3個土樣中相對豐度分別為0.45、0.15、0.17，其次是α-變形菌綱，在3個土樣中相對豐度分別為0.15、0.24、0.25。采伐跡地栽培和農(nóng)田栽培人參土樣中主要細菌類群比較接近，與林下護育人參土樣差異較大。尤其是酸性細菌綱、芽單胞菌綱和芽孢桿菌綱。在林下護育人參土樣中，酸性細菌綱和芽單胞菌綱幾乎未能檢測到，而在采伐跡地栽培人參土樣和農(nóng)田栽培人參土樣則含量較高。芽孢桿菌綱在林下護育人參土樣中的相對豐度高達0.09，在農(nóng)田栽培人參土樣中的相對豐度只有0.02，在采伐跡地栽培人參土樣中幾乎檢測不到。

表2 人參根際土壤樣品細菌群落分布表

由表3可知，真菌主要分布于以下10個綱：糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、Pezizomycotina_cls_Incertae_sedis1、毛霉綱(Mucoromycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)。不同栽培方式人參根際土樣中真菌菌群差異較小，糞殼菌綱為優(yōu)勢真菌菌群，在3種人參土樣中分別占65.49%、68.47%和48.58%，其次為座囊菌綱，分別占14.81%、3.84%和11.88%。其余真菌菌群在3個土樣中相對豐度大于1的只有錘舌菌綱，分別為2.70%、2.25%和1.87%。此外采伐跡地栽培人參根際土壤中傘菌綱占4.89%，而其他兩種栽培模式中傘菌綱相對豐度不足0.5%；散囊菌綱在林下護育和農(nóng)田栽培模式下分別有2.14%和1.80%，在采伐跡地栽培模式中不足1%。

表3 人參根際土壤樣品真菌群落分布表

2.3 人參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)屬水平上的相對分布

由圖3可知，細菌群落中假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等在林下護育模式土壤中有較高豐度。不動桿菌屬(Acinetobacter)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)和苔蘚桿菌屬(Bryobacter)等在采伐跡地栽培模式土壤中有較高豐度。芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、黃色土源菌屬(Flavisolibacter)等在農(nóng)田栽培模式土壤中相對豐度大于其他菌屬。此外，林下護育模式和采伐跡地栽培模式中鏈霉菌屬(Streptomyces)和伯克氏菌屬(unidentified_Burkholderiaceae)相對豐度較高，而農(nóng)田栽培模式土壤中卻極少。

圖3 人參根際土壤樣品細菌群落聚類熱圖

由圖4可知,真菌群落中相對豐度較高的真菌營養(yǎng)方式多為腐生，且糞生菌在各栽培模式中占均有較大比重。而不同栽培模式中優(yōu)勢真菌菌屬種類數(shù)目略有不同，如林下護育模式土壤中葡萄孢屬(Botrytis)、毛殼菌屬(Chaetomium)；采伐跡地栽培模式土壤中莖點霉屬(Phoma)、木霉屬(Trichoderma)；農(nóng)田栽培模式土壤中鐮孢菌屬(Fusarium)、柱孢霉屬(Cylindrocarpon)、分枝孢子霉屬(Cladosporium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)等，以上菌屬相對豐度均大于同種栽培模式下其他種類菌屬。

圖4 人參根際土壤樣品真菌群落聚類熱圖

2.4 人參根際土壤微生物多樣性分析

2.4.1 阿爾法(Alpha)多樣性分析

由表4可知，3種栽培模式土樣的細菌和真菌群落多樣性均具有較高豐富度。土樣中細菌多樣性Chao1指數(shù)平均值由大到小的順序為農(nóng)田栽培、采伐跡地栽培、林下護育；香濃指數(shù)由大到小的順序為采伐跡地栽培、農(nóng)田栽培、林下護育。說明細菌豐富度由大到小的順序為農(nóng)田栽培、采伐跡地栽培、林下護育；細菌多樣性由大到小的順序采伐跡地栽培、農(nóng)田栽培、林下護育。

表4 人參根際土壤樣品根際土壤群落多樣性指數(shù)

由表5可知真菌群落多樣性Chao1指數(shù)由大到小的順序為農(nóng)田栽培、林下護育、采伐跡地栽培；香濃指數(shù)由大到小的順序為林下護育、農(nóng)田栽培、采伐跡地栽培。即真菌豐富度由大到小的順序為農(nóng)田栽培、林下護育、采伐跡地栽培；真菌多樣性由大到小的順序為林下護育、農(nóng)田栽培、采伐跡地栽培。

表5 人參根際土壤樣品根際土壤群落多樣性指數(shù)

2.4.2 貝塔(Beta)多樣性分析

基于距離算法得到的3種土樣距離矩陣熱圖(圖5、圖6)，結(jié)合人參根際土壤樣品門水平樹狀聚類圖(圖7、圖8)可知，采伐跡地栽培和農(nóng)田栽參模式，人參根際土壤中細菌群落多樣性有較高相似度；人參林下護育栽培和采伐跡地栽培模式，人參根際土壤真菌群落多樣性具有較高的相似度。林下護育模式和農(nóng)田栽培模式的細菌和真菌群落多樣性相似度均處于較低的水平。

圖5 人參根際土壤樣品距離矩陣圖(細菌)

圖6 人參根際土壤樣品距離矩陣圖(真菌)

3 結(jié)論與討論

高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于根際土壤微生物的研究，與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，高通量測序技術(shù)能夠更加全面的揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。本研究采用高通量測序技術(shù)進行微生物擴增子測序分析，通過對比分析，發(fā)現(xiàn)擬細菌微生物中的γ-變形菌綱、α-變形菌綱、酸性細菌綱，真菌微生物中的糞殼菌綱、座囊菌綱、傘菌綱在人參根圍土壤微生物群落體系中占有很大比重，這與孫海等[14]的研究結(jié)果一致。

圖7 人參根際土壤樣品細菌門水平上樣本樹狀聚類

圖8 人參根際土壤樣品真菌門水平上樣本樹狀聚類

在林下護育、采伐跡地栽培和農(nóng)田栽培3種栽培模式下，農(nóng)田栽培人參根際土壤細菌多樣性最豐富，而林下護育人參根際土壤中真菌多樣性最豐富。林下護育模式中，細菌微生物種群豐富度和物種多樣性均小于其他兩種栽培模式，這與孫海等[14]、宋曉霞等[15]的研究結(jié)果有所不同，主要是采樣環(huán)境不同。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，集安市屬于山地流水地貌區(qū)，土壤中粗骨質(zhì)、障礙層次多，砂礫及礫石摻雜通體，土層淺，土質(zhì)薄，土壤透氣性好。林下護育模式屬于仿生栽培模式，除對人參進行掐花處理外，生長環(huán)境人為干預(yù)極少，經(jīng)過多年的自然篩選，大量有益微生物的擴繁、定植，在一定程度上限制了其群落多樣性的增長；林下護育模式微生物群落結(jié)構(gòu)朝著有利于人參生長的方向發(fā)展，趨于穩(wěn)定。與張亞玉等[16]在林下參根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中結(jié)論類似。而采伐跡地栽培模式和農(nóng)田栽培模式栽培時經(jīng)過人為干預(yù)[17]，尤其農(nóng)田栽培模式，栽培人參前進行土壤改良，人為添加了大量的微生物菌劑和生物肥料，使原生微生物群落被破壞，新生的微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，各種微生物處于無限制的爆發(fā)繁殖階段，這也是農(nóng)田栽培模式土壤中大量的糞生真菌的原因。不同栽培模式人參根際土壤細菌和真菌多樣性的差異是否存在廣泛性還有待進一步研究。

根際土壤中的病原微生物是導(dǎo)致植物發(fā)生土傳病害的主要來源[18]，不同栽培模式中病原微生物及拮抗微生物均有所不同。通過比較發(fā)現(xiàn)，林下護育模式中，人參灰霉病的致病病原菌葡萄孢屬的豐度較高，其他致病微生物相對豐度則不明顯，原因是林下護育栽培過程中沒有過多的人為干預(yù)，沒有藥劑噴施。拮抗菌方面，毛殼菌屬占有相當(dāng)大的比例，另外，鏈霉菌屬和伯克氏菌屬均有較高的相對豐度。遲玉杰等[19]發(fā)現(xiàn)毛殼菌屬含有較強的纖維素酶，能有效降解纖維素和有機質(zhì)、對多種病原菌的生長均有一定的抑制作用。在采伐跡地栽培模式中發(fā)現(xiàn)較高豐度的莖點霉屬和木霉屬，莖點霉屬可引起人參等藥用植物葉斑病[20]，而大多數(shù)木霉菌可產(chǎn)生多種對植物病原真菌、細菌及昆蟲具有拮抗作用的生物活性物質(zhì)[21]。除此之外，鏈霉菌屬和伯克氏菌屬相對豐度較高。而農(nóng)田栽培模式，多種致病菌均有較高豐度(如鐮孢菌屬、柱孢霉屬、分枝孢子霉屬、柱孢菌屬等)，鐮孢菌屬可侵染多種植物，引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害[22]，分枝孢子霉屬空氣中的優(yōu)勢真菌，能引起葉霉病、菌絲體病。農(nóng)田栽培模式并未發(fā)現(xiàn)明顯具有拮抗作用的真菌菌株。張鴻雁等[23]經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬對人參根系微生態(tài)有修復(fù)效應(yīng)，有促生防病的作用。而伯克氏菌屬除個別種與人類感染有關(guān)外，大多數(shù)用于防治多種植物真菌病害，主要用來防治腐霉病菌、立枯病菌和鐮刀病菌等引起的土傳病害[24-25]。毛欣欣等[26]發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌具有礦物風(fēng)化效應(yīng)，可以從鉀長石中釋放硅、鉀等元素，且對溫度、pH值等有一定的耐受性，而硅、鉀是人參生長的土壤化學(xué)環(huán)境特征[27]。目前并未發(fā)現(xiàn)在人參土壤改良中使用伯克氏菌屬，在林下護育人參根際土壤中發(fā)現(xiàn)的伯克氏菌屬，有望成為人參生物菌劑的備選生防資源。