高效液相色譜法檢測食品中Nisin的方法研究

朱明揚，余蓮芳，黃謙，高煒

（岳陽市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，湖南岳陽 414000）

Nisin是乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis subsp.lactis)的一種多肽產(chǎn)物，由34個氨基酸殘基組成，分子量約為3500 u[1]。它是一種世界公認的、無害的天然食品防腐劑和抗菌劑。目前已超過60個國家批注允許使用，包括歐盟、英國、美國和中國等[2]。我國食品安全最新頒布的《食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)中，Nisin批準用于乳制品、醬制品和熟肉制品（包括熟制水產(chǎn)品）等領域，并規(guī)定其使用限量。然而GB 1886.231-2016僅為現(xiàn)行乳酸鏈球菌素檢驗的產(chǎn)品標準，2017年1月1日實施，卻未有關(guān)于Nisin作為一種食品添加劑的分析檢測方法標準。

目前國內(nèi)外關(guān)于Nisin的檢測方法主要包括瓊脂擴散法[3]、生物熒光法[4]、電泳法[5]、比濁法[6]和免疫吸附法[7,8]等。隨著近年高效液相色譜儀和氣相色譜儀在科研院所和檢測單位的普及，儀器分析取代化學分析和生物分析的標準越來越多，方便了大批次情況下的檢測工作。關(guān)于HPLC檢測Nisin的相關(guān)報道，如高彩紅等[2]采用HPLC檢測發(fā)酵食品中Nisin的含量，分別對固體和液體樣品前處理，在紫外檢測波長 220 nm下，梯度洗脫70 min，結(jié)果表明線性關(guān)系、回收率和相對標準偏差良好；黃謙和高煒等[9]以辣蒜醬為研究對象，HPLC評價了Nisin的溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度；同時優(yōu)化了食品中 Nisin的提取條件，以乙腈和稀鹽酸(pH=2)為提取溶劑，經(jīng)超聲和水浴處理，梯度洗脫 34 min，結(jié)果表明回收率為 92.54%，RSD＜3%；Efstathios等[6]研究比較了HPLC和濁度法定性定量檢測乳酸鏈球菌素，采用有機溶劑沉淀、離子交換色譜和固相萃取凈化處理樣品，梯度洗脫 44 min，并用外標法對吸收光譜分析和精確定量，得出高效液相色譜法靈敏度和準確度比濁度分析法高。

一些學者也對Nisin凈化處理過程進行了研究，如Borzenkov等[10]對比了疏水性膜、離子交換和疏水色譜法凈化處理方式，結(jié)果表明色譜法凈化效果明顯；有學者也分析了凈化處理乳酸菌細菌素的關(guān)鍵問題，并提出凈化效率的改善過程。因此，Nisin的檢測較多局限在產(chǎn)量、方法比對及純化，而少有關(guān)于作為添加劑針對食品的檢測方法，且關(guān)于我國食品安全標準中Nisin檢測的研究非常少。

本文以14種食品為研究對象，系統(tǒng)地對食品分類提取、優(yōu)化色譜條件，進而確定一種易操作、回收率高、精確度高、穩(wěn)定性好、重復性好、檢出限低的HPLC檢測方法。這既提高了食品中 Nisin的安全性控制，降低了食品安全隱患，同時也對建立檢測食品中Nisin的高效液相色譜法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

依照《食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)，收集乳制品、醬制品和熟肉制品（包括熟制水產(chǎn)品、以魚制品為重點）共三類14種食品（見表1），均在市場上購買。

其中熟肉制品的醬汁魷魚、鴨小腿、九鹵醬辣脖已在市場流通的產(chǎn)品中，標注添加乳酸鏈球菌素作為防腐劑。

表1 樣品收集Table 1 Sample collection

乳酸鏈球菌素標準品(純度 98%以上，生物試劑900 IU/mg)，源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜級)，Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；三氟乙酸(分析純)，天津市光復精細化工研究所；濃鹽酸(分析純)，株洲市星空化玻有限責任公司。

Agilent 1100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

Smart 2 Pure超純水機，賽默飛世爾科技有限公司；PHS-3C pH計，上海精科有限公司；KQ-600E數(shù)控超聲波清洗器和 KQ-700DE電子恒溫不銹鋼水浴鍋，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸鏈球菌素標準貯備液制備(20mg/mL)

稱取1.0 g(精確至0.00001 g)標準品于50 mL容量瓶中，加稀鹽酸(pH=2)定容，4 ℃冰箱保存，有效期1個月。

1.2.2 乳制品、醬制品和熟肉制品提取液制備

稱取攪拌均勻樣品20g(精確至0.0001 g)于50 mL離心管中，加入乙腈和稀鹽酸，稀鹽酸百分比分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%（當稀鹽酸百分比為60%時，先加入6 mL乙腈，再加入9 mL的稀鹽酸(pH=2)），共 15 mL(熟肉制品 25 mL)，于 2000 r/min下高速振蕩混勻，30 ℃超聲20 min，再50 ℃下水浴40 min，4 ℃ 10000 r/min離心20 min。取下層提取液過0.22 μm濾膜，測定Nisin含量[9]。做三個平行，以標品為對照，提取液中的Nisin含量以回收率表示，公式如式（1）。

其中X為Nisin含量的回收率(%)；m1為加標量(IU)；m2為檢測量(IU)。

1.2.3 標準曲線的繪制

準確吸取標準儲備液12.5 mL置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配置成濃度為5 mg/mL標準工作液。再準確吸取標準工作液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL至10 mL容量瓶中。其乳酸鏈球菌素標準溶液的最終效價分別為 180 IU/mL、360 IU/mL、540 IU/mL、720 IU/mL、900 IU/mL、1800 IU/mL、2700 IU/mL、3600 IU/mL、4500 IU/mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣，以效價為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 色譜條件

參考黃謙等[9]、Efstathios等[6]報道的高效液相色譜法，略作修改后對Nisin含量進行高效液相色譜法檢測。通過對比標準物質(zhì)的保留時間和光譜以及添加標準物質(zhì)到樣品中判定可疑峰，并制作標準曲線，采用外標法進行定量。

色譜條件：色譜柱，TC-18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相，0.1%三氟乙酸和 10%乙腈的水溶液(A)、0.07%三氟乙酸和90%乙腈的水溶液(B)；梯度洗脫程序如表2；流速為1.2 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL；檢測波長為220 nm。

表2 流動相洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.2.5 精密度試驗

取樣品提取液，連續(xù)進樣6針測定[11]。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

取樣品提取液6份，分別在4 ℃下保存0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h 后測定[11]。

1.2.7 重復性試驗

樣品提取液各制備6份待測定[11]。

1.2.8 檢出限

取樣品提取液，進樣測定，分析色譜圖并計算信燥比和檢出限[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳制品中Nisin提取的回收率

圖1 提取溶劑對R-3中Nisin回收率的影響Fig.1 The effect of solvent extraction on the recovery rate of Nisin in R-3

圖2 稀鹽酸百分比為60%時，乳制品中Nisin的回收率Fig.2 The recovery rate of Nisin in dairy products in the percentage of diluted hydrochloric acid is 60%

圖3 R-1 1800 IU/mL提取液色譜圖Fig.3 Chromatogram of R-11800 IU/mL extract liquid

由圖1可知，以R-3為研究對象，相同的Nisin添加量，在稀鹽酸百分比分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%的溶劑提取下表現(xiàn)出極顯著的差異(p＜0.01)。其中，當稀鹽酸百分比為 60%時，回收率最高為90.40%，隨著提取溶劑稀鹽酸百分比增加或減少，回收率均下降。當提取溶劑稀鹽酸百分比減少到20%時，Nisin未檢出。龔東磊[12]等研究了Nisin對活性益生菌乳飲料的抑菌性，結(jié)果表明少量的 Nisin添加量，可以顯著性地延長產(chǎn)品的酸化變質(zhì)。

以乳制品R-1、R-2、R-3、R-4、R-5為研究對象，相同的Nisin添加量，加入6 mL乙腈、再加入9 mL的稀鹽酸(pH=2)作為提取溶劑的回收率，如圖2所示。其中，R-5回收率最高為98.69%，R-1回收率次之為93.79%，再依次是 R-3、R-4、R-2，回收率均在86%～100%之間。樣品色譜圖如圖3所示，在5～12 min內(nèi)均實現(xiàn)了基線分離，且分型尖銳明顯。

2.2 醬制品中Nisin提取的回收率

圖4 提取溶劑對J-1中Nisin回收率的影響Fig.4 The effect of solvent extraction on the recovery rate of Nisin in J-1

由圖4可知，以J-1為研究對象，相同的Nisin添加量，在稀鹽酸百分比分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%的溶劑提取下表現(xiàn)出極顯著的差異(p＜0.01)。

其中，當稀鹽酸百分比為40%時，回收率最高為93.51%，隨著提取溶劑稀鹽酸百分比增加或減少，回收率均下降。當提取溶劑稀鹽酸百分比減少到0%時，Nisin未檢出。

圖5 稀鹽酸為40%時，醬制品中Nisin的回收率Fig.5 The recovery rate of Nisin in sauce products with the percentage of diluted hydrochloric acid of 40%

圖6 J-1 1800IU/mL提取液色譜圖Fig.6 Chromatogram of J-11800 IU/mL extract liquid

王莉嫦[13]等研究了Nisin在雞汁鮑魚罐頭中的應用，正交試驗優(yōu)化得到Nisin濃度為300 mg/kg時，產(chǎn)品口感好，成本低。Hsieh[14]等研究了Nisin在豆?jié){、大蒜中的協(xié)同作用，結(jié)果表明抑制李斯特菌作用增強。

以醬制品J-1、J-2、J-3為研究對象，相同的Nisin添加量，加入9 mL乙腈、再加入6 mL的稀鹽酸(pH=2)作為提取溶劑的回收率，如圖5所示。其中，J-1回收率最高為93.04%，J-2回收率次之為87.49%，最低的是J-3為85.91%。樣品色譜圖如圖6所示，在5～9 min內(nèi)均實現(xiàn)了基線分離，且分型尖銳明顯。

2.3 熟肉制品中Nisin提取的回收率

圖7 提取溶劑對SR-3中Nisin回收率的影響Fig.7 The effect of solvent extraction on the recovery rate of Nisin in SR-3

由圖7可知，以SR-3為研究對象，相同的Nisin添加量，在稀鹽酸/乙腈百分比分別為 100%、80%、60%、40%、20%、0%的溶劑提取下表現(xiàn)出極顯著的差異(p＜0.01)。其中，當稀鹽酸/乙腈百分比為60%時，回收率最高為104.5%，隨著提取溶劑稀鹽酸百分比增加或減少，回收率均下降。當提取溶劑稀鹽酸百分比減少到20%時，Nisin未檢出。

賈曉云[15]、Fernanda[16]和溫斯穎[17]等分別研究了鮮肉、熟肉和火腿中Nisin的抗菌作用，結(jié)果表明菌的數(shù)量急劇降低。

圖8 稀鹽酸為60%時，熟肉制品中Nisin的回收率Fig.8 The recovery rate of Nisin in cooked meat product with the percentage of diluted hydrochloric acid of 60%

圖9 SR-1 1800 IU/mL提取液色譜圖Fig.9 Chromatogram of SR-11800 IU/mL extract liquid

以熟肉制品 SR-1、SR-2、SR-3、SR-4、SR-5、SR-6為研究對象，相同的Nisin添加量，加入10 mL乙腈、再加入15 mL的稀鹽酸(pH=2)作為提取溶劑的回收率，如圖 8所示。其中，SR-3回收率最高為101.34%，SR-5回收率次之為99.72%，再依次是SR-6、SR-2、SR-4、SR-1，回收率均在79%～100%之間。樣品色譜圖如圖9所示，在5～12 min內(nèi)均實現(xiàn)了基線分離，且分型尖銳明顯。

2.4 標準曲線的繪制

圖10 220 nm標準曲線(a)和光譜圖(b)Fig.10 220 nm standard curve (a) and spectrogram (b)

由圖10a可知，180 IU/mL、360 IU/mL、540 IU/mL、720 IU/mL、1800 IU/mL、2700 IU/mL、4500 IU/mL共7個不同濃度的標準溶液制作標準曲線。結(jié)果表明：以效價為橫坐標，以峰面積為縱坐標，線性關(guān)系為Y=0.114X-5.725，r=0.99992。圖10b為乳酸鏈球菌素目標峰的光譜圖，最大吸收波長為220 nm。圖11為1800 IU/mL標液在吸收波長為220 nm下的色譜圖。

圖11 標液（1800 IU/mL）色譜圖Fig.11 Chromatogram of standard liquid (1800 IU/mL)

2.5 高效液相色譜法的精密度、穩(wěn)定性、重復性、檢出限試驗

由表3可知，以R-3、J-1、SR-3為研究對象，采用1.2.4高效液相色譜條件分別對其精密度、穩(wěn)定性、重復性、檢出限試驗。

表3 R-3、J-1、SR-3樣品高效液相色譜法的精密度、穩(wěn)定性、重復性和檢出限試驗Table 3 The precision, stability, repeatability and detection limit test of HPLC in R-3, J-1 and SR-3

6 7.66 515.8 7.69(96 h) 159.2 7.61 192.0 RSD/% 0 1.00 0.37 7.65 0.32 2.05醬制品 900 IU/mL J-1 J-1 J-1 1 7.87 89.5 7.81(0 h) 184.6 7.81 184.6 2 7.87 91.0 7.84(6 h) 183.9 7.79 188.9 3 7.87 92.2 7.90(12 h) 183.8 7.80 176.8 4 7.87 88.8 7.74(24 h) 180.9 7.81 182.9 5 7.87 89.7 7.74(48 h) 177.1 7.79 177.1 6 7.87 91.9 7.68(96 h) 170.3 7.78 186.3 RSD/% 0 1.53 1.03 3.08 0.15 2.69熟肉制品(包括熟制水產(chǎn)品) 1800 IU/mL SR-3 SR-3 SR-3 1 7.3 198.9 7.21(0 h) 201.4 7.20 201.4 5.80 205 IU/mL 2 7.32 202.1 7.26(6 h) 199.2 7.19 210.8 3 7.32 197.4 7.20(12 h) 196.6 7.18 192.6 4 7.32 204.0 7.19(24 h) 191.0 7.19 198.2 5 7.32 200.5 7.08(48 h) 182.3 7.20 200.0 6 7.32 199.3 7.17(96 h) 164.9 7.19 186.7 RSD/% 0 1.19 0.83 9.37 0.10 4.13 5.67 198 IU/mL

表4 高效液相色譜法檢測14種食品中Nisin的試驗結(jié)果Table 4 The results of Nisin in 14 foods detected by HPLC

結(jié)果表明：精密度保留時間的RSD均為0，峰面積的RSD均小于1.6%，精密度高；穩(wěn)定性保留時間的RSD均小于1.1%，峰面積的RSD以J-1為最低，穩(wěn)定性較好；重復性保留時間的RSD均小于0.4%，峰面積的RSD以R-3為最低，重復性好，其次J-1；檢出限以R-3最低為194 IU/mL，J-1和SR-3分別是205 IU/mL、198 IU/mL；表4為14種食品中Nisin的試驗結(jié)果。

3 結(jié)論

3.1 乳制品、醬制品和熟肉制品中乳酸鏈球菌素提取表明：稀鹽酸百分比分別為60%、40%和60%，經(jīng)超聲、水浴、離心，得到的回收率分別為90.40%、93.51%和104.50%。

3.2 高效液相色譜法得出：TC-18色譜柱(4.6 mm×250mm，5 μm)；流動相，0.1%三氟乙酸和10%乙腈的水溶液(A)、0.07%三氟乙酸和90%乙腈的水溶液(B)；梯度洗脫16 min；檢測波長為220 nm。以R-3、J-1、SR-3為研究對象，該方法分別對其精密度、穩(wěn)定性、重復性、檢出限試驗，結(jié)果表明：保留時間的RSD均小于1.1%；精密度高；穩(wěn)定性以J-1為最佳；重復性以R-3為最佳，其次J-1；檢出限以R-3最低為194 IU/mL，J-1和SR-3分別是205 IU/mL、198 IU/mL。