沐舒坦預(yù)處理對(duì)大鼠急性肺損傷的肺保護(hù)作用研究

徐忠能，薛濤

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 胸外科，江蘇 南京 210009)

臨床上誤吸為最常見(jiàn)的直接肺損傷原因之一，而一旦胃內(nèi)容物誤吸并發(fā)展為急性肺損傷(ALI/ARDS)死亡率高達(dá)40%～60%[1- 2]，因此，如何進(jìn)行肺保護(hù)一直是臨床研究的重要課題。沐舒坦(Ambroxol)是一種具有多種生物學(xué)活性的黏液溶解劑。Park[3]、Pfeifer[4]、Gillissen[5]等研究發(fā)現(xiàn)，大劑量沐舒坦可以通過(guò)抗炎、抗氧化及促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)生成等方式起到肺保護(hù)作用。近些年國(guó)內(nèi)相關(guān)臨床研究[6]也證實(shí)，大劑量沐舒坦具有一定的肺保護(hù)作用。然而關(guān)于沐舒坦的劑量選擇上仍未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究擬通過(guò)觀察不同劑量的沐舒坦預(yù)處理對(duì)鹽酸吸入致大鼠急性肺損傷模型的肺保護(hù)作用，為臨床沐舒坦應(yīng)用劑量選擇提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)40只，體重170～220 g。

1.1.2 試劑 沐舒坦由上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司提供，TNF- α、IL- 10試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 將40只健康清潔成年的SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組8只：生理鹽水組(吸入生理鹽水)、稀鹽酸組(吸入稀鹽酸)、稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量處理組[吸入稀鹽酸+沐舒坦(10 mg·kg-1·d-1)、稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量處理組[吸入稀鹽酸+沐舒坦(20 mg·kg-1·d-1)]、稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量處理組[吸入稀鹽酸+沐舒坦(40 mg·kg-1·d-1)]。稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組分別予相應(yīng)劑量沐舒坦尾靜脈注射，生理鹽水及稀鹽酸兩組予等體積的生理鹽水行尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3 d，期間大鼠自由接觸食物和水。第3天尾靜脈注射沐舒坦或生理鹽水30 min后各組大鼠再腹腔注射10%水合氯醛3 ml·kg-1麻醉，待肢痛反射消失后參照Nader等[7]的方法并略作改進(jìn)制作鹽酸吸入性肺損傷模型。將大鼠固定于操作臺(tái)，呈頭高位60°，頸部備皮消毒，沿頸部中線剪開(kāi)皮膚，分離各層組織至暴露氣管。用1 ml注射器針頭經(jīng)暴露的環(huán)甲膜處插入，生理鹽水組大鼠氣管內(nèi)注射生理鹽水(1.2 ml·kg-1)，稀鹽酸組，稀鹽酸+沐舒坦低、中、高劑量處理組大鼠氣管內(nèi)滴注稀鹽酸(1.2 ml·kg-1，pH=1.2)。注完藥物后仍保持此體位3 min，拔出注射器，用1號(hào)絲線逐層縫合傷口，局部消毒后將大鼠固定帶松開(kāi)置于觀察箱中觀察。讓大鼠自主呼吸空氣，并允許大鼠自由接觸水和食物。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 生理鹽水或稀鹽酸吸入后觀察6 h，期間無(wú)大鼠死亡。6 h后存活大鼠予10%水合氯醛3 ml·kg-1腹腔注射麻醉，待肢痛反射消失后將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，快速開(kāi)胸，于心尖處抽取動(dòng)脈血，分成兩份血標(biāo)本，一份迅速行動(dòng)脈血?dú)夥治觯硪环莸蜏叵码x心(3 000 r·min-1)10 min，吸取上清，-80 ℃保存，留待后期統(tǒng)一應(yīng)用放射免疫方法測(cè)量血清中TNF- α、IL- 10含量。抽血后立即取出完整肺臟，右肺稱濕重后置于80 ℃烘箱中，48 h后稱干重，計(jì)算W/D。左肺置4%甲醛中固定，石蠟包埋，病理切片HE染色后行普通光學(xué)顯微鏡檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理變化

2.1.1 大體觀察 生理鹽水組呈均勻的粉白色，表面光滑，無(wú)出血灶，彈性好；稀鹽酸組呈暗紅色，可見(jiàn)明顯充血水腫及散在出血點(diǎn)；稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組也可見(jiàn)局部充血水腫和滲液，但較稀鹽酸組損傷范圍及損傷程度明顯減輕，且隨著沐舒坦劑量遞增，肺損傷表現(xiàn)越輕。

2.1.2 光鏡觀察 生理鹽水組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁及間質(zhì)內(nèi)無(wú)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等特殊改變。稀鹽酸組肺泡壁破壞嚴(yán)重，大量肺泡萎陷，肺泡、肺間質(zhì)水腫明顯，肺泡間隔增寬，組織中可見(jiàn)點(diǎn)狀出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組肺泡及間質(zhì)水腫較稀鹽酸組有所減輕，仍可見(jiàn)部分肺泡萎陷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀出血改變。稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量?jī)山M病理改變較輕，組織稍疏松，毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血，間質(zhì)輕度水腫。見(jiàn)圖1～5。

圖1生理鹽水組織病理變化HE×100

圖2稀鹽酸組肺組織病理變化HE×100

2.2 肺濕干重比(W/D)

W/D值生理鹽水組最低，稀鹽酸組最高，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量處理組介于生理鹽水和稀鹽酸組兩組之間，且隨著沐舒坦劑量遞增，W/D值遞減，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量處理組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖3Hcl+沐舒坦低劑量處理組肺組織病理變化HE×100

圖4Hcl+沐舒坦中劑量處理組肺組織病理變化HE×100

圖5Hcl+沐舒坦高劑量處理組肺組織病理變化HE×100

組 別n濕干比生理鹽水組84.28±0.18稀鹽酸組85.03±0.22a稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組84.81±0.21ab稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組84.62±0.12abc稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組84.53±0.18abc

與生理鹽水組比較，aP<0.05；與稀鹽酸組比較，bP<0.05；與稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組比較，cP<0.05

2.3 血?dú)夥治?/h3>

生理鹽水組pH值在正常范圍，余4組pH皆低于7.35。稀鹽酸組，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，稀鹽酸組,稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量4組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。PaO2值生理鹽水組最高，稀鹽酸組最低，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組PaO2與沐舒坦劑量呈正相關(guān)，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組之間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，余組間比較均有顯著差異(均P<0.05)。稀鹽酸組PaCO2最高，與生理鹽水組，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，生理鹽水組，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量4組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 血清TNF- α、IL- 10 測(cè)定結(jié)果

血清TNF- α水平稀鹽酸組最高，生理鹽水組最低，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組血清中TNF- α含量與沐舒坦劑量呈負(fù)相關(guān)，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。血清中IL- 10含量按生理鹽水組、稀鹽酸組、稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組順序依次增高，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸吸入致大鼠急性肺損傷模型(按1.2 ml·kg-1吸入pH 1.2的稀鹽酸)。與吸入生理鹽水的對(duì)照組相比，吸入鹽酸組的大鼠明顯活力下降，呼吸急促，煩躁不安，紫紺；PaO2明顯降低，PaCO2、肺W/D、促炎性因子TNF- α明顯增高。光鏡下病理切片示肺泡壁破壞嚴(yán)重，大量肺泡萎陷，肺泡、肺間質(zhì)水腫明顯，肺泡間隔增寬，組織中可見(jiàn)點(diǎn)狀出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。說(shuō)明采用1.2 ml·kg-1，pH 1.2的稀鹽酸吸入制作大鼠急性肺損傷模型成功。

組 別 npHPaO2PaCO2生理鹽水組87.36±0.0397.46±1.1634.35±1.73稀鹽酸組87.17±0.04a59.04±5.32a42.75±5.81a稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組87.20±0.03a69.50±5.84ab38.38±3.12b稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組87.24±0.05a80.75±3.55abc36.81±2.25b稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組87.25±0.06a83.54±3.27abc35.35±3.51b

與生理鹽水組比較，aP<0.05；與稀鹽酸組比較，bP<0.05；與稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組比較，cP<0.05

組 別 nTNF-α/pg·m-1IL-10/pg·m-1生理鹽水組859.99±6.9212.38±0.93稀鹽酸組8178.32±16.29a21.48±1.51a稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組8125.79±13.54ab29.15±1.14ab稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組887.50±8.34abc34.70±2.20abc稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組880.28±9.19abc35.63±2.31abc

與生理鹽水組比較，aP<0.05，與稀鹽酸組比較，bP<0.05；與稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組比較，cP<0.05

酸吸入性肺損傷的發(fā)生機(jī)制曾被認(rèn)為主要是胃液內(nèi)酸性物質(zhì)和消化酶對(duì)肺組織的直接損傷。但近些年一些研究[8- 9]證實(shí)，局部損傷后的炎癥反應(yīng)在肺損傷的發(fā)生發(fā)展中扮有更重要的角色。主要表現(xiàn)為肺巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的激活，產(chǎn)生和釋放大量炎癥因子和生物介質(zhì)，趨化大量中性粒細(xì)胞在肺臟聚集并被激活，產(chǎn)生活性氧自由基等，造成廣泛的嚴(yán)重的炎性損傷。TNF- α是急性肺損傷過(guò)程中最早產(chǎn)生的炎性介質(zhì)之一[10]，其可激活損傷的中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步釋放氧自由基、溶酶體酶等介質(zhì)，誘導(dǎo)組織細(xì)胞損傷，引起急性肺損傷。本實(shí)驗(yàn)中，鹽酸吸入后，大鼠血清中TNF- α含量明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明了炎癥反應(yīng)被啟動(dòng)。

沐舒坦是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的黏液溶解劑，但近年來(lái)許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大劑量的沐舒坦具有一定的肺保護(hù)作用。主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1) 抗炎、抗氧化作用。沐舒坦可降低血液中活性氧水平，通過(guò)活化的中性粒細(xì)胞，降低超氧負(fù)離子、HCLO的水平，以抑制A1AT的鈍化，從而改善肺功能參數(shù)[11]。(2) 促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)合成。(3) 松弛氣道平滑肌。(4) 對(duì)氣道壁離子轉(zhuǎn)運(yùn)和電位差的影響。IL- 10是一種重要的抑炎因子，在肺內(nèi)主要由單核巨噬細(xì)胞等合成和分泌。本實(shí)驗(yàn)觀察了10、20、40 mg·kg-13種劑量的沐舒坦對(duì)肺的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，沐舒坦治療組血清IL- 10水平較稀鹽酸組明顯升高，TNF- α水平明顯降低。而且血清IL- 10水平隨沐舒坦劑量遞增而增高，而TNF- α水平則降低。由此表明，3種不同劑量的沐舒坦都能明顯減輕肺部炎性反應(yīng)，促進(jìn)抗炎反應(yīng)，減輕肺泡及間質(zhì)水腫和肺組織出血等病理改變。同時(shí)血?dú)饨Y(jié)果表明，沐舒坦還可明顯改善低PaO2狀況，降低PaCO2。但稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量3組組間比較發(fā)現(xiàn)，稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量與稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組之間TNF-α和IL- 10水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組與稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組之間TNF- α和IL- 10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明在一定劑量范圍之內(nèi)，沐舒坦對(duì)急性肺損傷保護(hù)作用與劑量呈正相關(guān)，但超過(guò)一定范圍時(shí)，這種正相關(guān)作用并不明顯。

大劑量沐舒坦的肺保護(hù)作用在臨床上已經(jīng)引起廣泛重視，但在應(yīng)用劑量的選擇上國(guó)內(nèi)仍無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[12]。目前國(guó)內(nèi)研究主要集中于急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征和圍手術(shù)期肺保護(hù)方面。本實(shí)驗(yàn)中僅采用酸吸入制作大鼠急性肺損傷模型來(lái)研究不同劑量沐舒坦的肺保護(hù)作用，由于實(shí)驗(yàn)中控制因素太多，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全套用于臨床實(shí)際工作中。關(guān)于沐舒坦肺保護(hù)作用與劑量的相關(guān)性仍需大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用情況來(lái)繼續(xù)探討。

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