HPLC法同時(shí)測(cè)定油茶籽油中的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯

林樹真，龍婷，段明慧，史慶龍，葛發(fā)歡，周丹

（1.廣州市金妮寶食用油有限公司，廣東廣州 511475）（2.中山大學(xué)南沙研究院，廣東廣州 511458）（3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

油茶籽油是從山茶科油茶樹的種子中獲得，是我國(guó)最古老的木本食用植物油之一。中國(guó)是世界上山茶科植物分布最廣的國(guó)家，也是茶油最大的生產(chǎn)基地，此外東南亞、日本等國(guó)家有極少量的分布[1]。油茶籽油具有預(yù)防各種心腦血管疾病、延緩動(dòng)脈粥樣硬化降血脂、降血壓等功效[2～4]，是一種優(yōu)質(zhì)的保健食用油。經(jīng)報(bào)道，油茶籽油的不飽和脂肪酸均高于橄欖油，理化特性與其也極為相似，從而被譽(yù)為“東方橄欖油”[5～7]。目前，油茶籽油被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為健康型高級(jí)食用植物油重點(diǎn)推廣，深受廣大消費(fèi)者的青睞[8]。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)生活的品質(zhì)的要求越來(lái)越高，對(duì)日常所需的食用油脂的安全與品質(zhì)更加關(guān)注，要求也更為嚴(yán)格，因而優(yōu)質(zhì)的食用油逐漸成為現(xiàn)代生活的必需品。

食用植物油均由皂化物和不皂化物兩大部分組成，皂化物部分占99%左右，主要包括三酰甘油和游離脂肪酸，其中三酰甘油的脂肪酸主要由飽和脂肪酸和不飽和脂肪脂肪酸組成[9]。不皂化物占1%左右，包括游離醇、三萜烯、生育酚、維生素、甾醇和角鯊烯等成分。這些有益于人體健康的活性成分是評(píng)價(jià)植物油質(zhì)量的重要指標(biāo)。

目前，國(guó)內(nèi)外油茶籽油的成分研究主要集中在脂肪酸的種類[10～12]，對(duì)不皂化物類的活性成分研究相對(duì)缺乏。任傳義等對(duì)油茶籽油等植物油中的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析[13]，通過(guò)氣相色譜法對(duì)角鯊烯和β-谷甾醇進(jìn)行了含量測(cè)定，液相色譜法對(duì)維生素E的含量的進(jìn)行測(cè)定，但是針對(duì)油脂樣品的氣相檢測(cè)和液相檢測(cè)，必須分別制樣，過(guò)程繁瑣，方法復(fù)雜。

張東生、鐘冬蓮等[14,15]通過(guò)氣相色譜法等對(duì)油茶籽油中的角鯊烯進(jìn)行了定量分析，成分分析單一。關(guān)于用液相方法同時(shí)測(cè)定油茶籽油中多種營(yíng)養(yǎng)成分的文獻(xiàn)尚未見報(bào)道，本文建立了一種高效液相檢測(cè)方法，對(duì)油茶籽油中的生育酚、甾醇和角鯊烯的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)方法的可靠性進(jìn)行了全面的考察，為油脂的品質(zhì)分析提拱了有效的途徑，對(duì)于更好的開發(fā)和推廣油茶籽油資源和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 原料

油茶籽油來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室超臨界設(shè)備萃取；γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉丁，純度96%），β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉丁，純度＞95%），角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉丁，純度＞95%）；乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司），二氯甲烷、甲酸（分析純，廣州化工廠），超純水自制。

1.2 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)戴安高效液相色譜儀 UltiMate 3000（包括梯度泵SR-3000、自動(dòng)進(jìn)樣器WPS-3000、柱恒溫系統(tǒng)TCC-3000、檢測(cè)器DAD-3000、色譜工作站變色龍7.2）；色譜柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。XS205 Dual Range型十萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-500E超聲波處理器(昆山超聲設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC色譜條件的建立

選用三種不同色譜柱：Phenomenon Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，考察對(duì)樣品的分離效果；在不同的波長(zhǎng)（205 nm、210 nm、283 nm、300 nm）條件對(duì)比分析，選擇最佳波長(zhǎng)。樣品流動(dòng)相：100%甲醇；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；等度洗脫。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制

稱取10.0 mg的γ-生育酚，加甲醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成濃度為1.00 mg/mL的γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；稱取10.9 mg的β-谷甾醇，加甲醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成濃度為1.09 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；稱取13.9 mg的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，加入甲醇/二氯甲烷（V/V=1:1）溶液定容至刻度線，配制成濃度為1.39 mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.3.3 供試品的制備

稱取5 g左右的供試品于250 mL的容量瓶中，加入50 mL的1 mol/L的氫氧化鉀的乙醇溶液。于90 ℃的水浴鍋中回流 2 h。停止加熱，從回流管頂部加入50 mL水并旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)。

冷卻后轉(zhuǎn)移皂化液到250 mL分液漏斗中，加入50 mL正己烷，蓋好旋塞，用力搖1 min，倒轉(zhuǎn)分液漏斗，并小心打開旋塞，間歇地釋放內(nèi)壓，靜置分液漏斗，至溶液分層后（如果形成乳液，須加入少量乙醇溶液破乳）。

將下層皂化液放入第二只分液漏斗中。用相同的方法，每次用50 mL正己烷對(duì)皂化液萃取兩次。將三次收集的正己烷置于同一分液漏斗中。

用10%的乙醇水溶液，洗滌上述提取液，每次用量25 mL，并劇烈搖動(dòng)，洗滌后棄去乙醇水溶液，每次棄去洗滌液后，保持分液漏斗中剩余2 mL洗滌液，然后將分液漏斗沿其軸成線旋轉(zhuǎn)，靜置數(shù)分鐘，使剩余的乙醇水相進(jìn)一步分離，然后棄去。繼續(xù)用乙醇水溶液洗滌，直到洗滌液加入1滴酚酞后不呈現(xiàn)粉紅色為止。

通過(guò)分液漏斗的上口小心地將正己烷溶液轉(zhuǎn)移到至圓底燒瓶中，在 50 ℃條件下，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除掉溶劑。將燒瓶中的殘留物轉(zhuǎn)移至5 mL的容量中，加入甲醇/二氯甲烷（V/V=1:1）溶液定容至刻度線，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，進(jìn)液相。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件建立

通過(guò)對(duì)Phenomenon Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱子的考察和不同波長(zhǎng)的紫外吸收考察，最終確定的HPLC色譜條件為：色譜柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：100%甲醇；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；等度洗脫。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the camellia oil

在確定的色譜條件下，通過(guò)測(cè)定“1.3.2”中的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，與樣品進(jìn)行一一核對(duì)，對(duì)油茶籽油樣品中的相關(guān)組分進(jìn)行了定性分析。結(jié)果如圖1所示定性出的三種營(yíng)養(yǎng)成分為：γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取適量的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯對(duì)照品，稀釋到不同的濃度，在“1.3.1”條件下，進(jìn)行液相分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制如下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。γ-生育酚回歸方程為：y=237.89x-0.052，R2=1；β-谷甾醇的回歸方程為：y=5.32x-0.0053，R2=0.9999；角鯊烯的回歸方程分別為：y=80.15x-0.528，R2=0.9990。結(jié)果表明，γ-生育酚在 0.01～0.40 μg，β-谷甾醇在 0.44～10.94 μg，角鯊烯在0.01～0.55 μg 呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

取γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯對(duì)照品溶液，各連續(xù)進(jìn)樣6次，以對(duì)照品的峰面積計(jì)算精密度。結(jié)果如表 1所示，γ-生育酚的 RSD=0.19%，β-谷甾醇的RSD=0.47%，角鯊烯的RSD=0.86%。上述結(jié)果均符合試驗(yàn)要求。

表1 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

表2 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Stability of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

取同一批次樣品，樣品按照“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件，于 0、2、4、6、8 h分別測(cè)定，以γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的含量來(lái)考察穩(wěn)定性，結(jié)果如表2，γ-生育酚的RSD=1.92%，β-谷甾醇的RSD=1.72%，角鯊烯的RSD=1.88%。上述結(jié)果均符合試驗(yàn)要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品，平均制備6份，按照“1.3.3”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，連續(xù)進(jìn)樣，以γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的含量來(lái)考察重復(fù)性。γ-生育酚的 RSD=0.86%，β-谷甾醇的RSD=1.48%，角鯊烯的RSD=1.32%。上述結(jié)果均符合試驗(yàn)要求。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)含量的同一批樣品，按照“1.3.3”項(xiàng)的方法制備樣品，精密移取一定體積的上述溶液，加入適量的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定其含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果如表4、表5和表6所示，γ-生育酚的 RSD=1.28%，β-谷甾醇的RSD=1.54%，角鯊烯的RSD=1.58%。上述結(jié)果均符合試驗(yàn)要求。

表3 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

表4 γ-生育酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Average recoveries of γ-antisterility vitamin

表5 β-谷甾醇加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Average recoveries of β-sitosterol

表6 角鯊烯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Average recoveries of squalene

2.7 樣品含量測(cè)定

取同一條件下制備的不同批次的超臨界萃取的油茶籽油，按照“1.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，檢測(cè)樣品中γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的含量。油茶籽油液相色譜圖如圖1所示，檢測(cè)結(jié)果如表7所示，表明三批樣品的測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好。

表7 油茶籽油樣品中營(yíng)養(yǎng)成分的含量(mg/100g)Table 7 Determination of nutrient content in camellia oil samples

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種高效、快速檢測(cè)油茶籽油中的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯的方法。通過(guò)對(duì)該方法線性度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率的考察，結(jié)果表明該方法有效可信，可以用于油茶籽油的品質(zhì)控制，對(duì)油茶籽油的推廣應(yīng)用具有重要意義。在該方法下，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室超臨界提取的同一條件下，不同批次的油茶籽油進(jìn)行了相關(guān)分析，重復(fù)性較好。