甘薯葉提取物中酚類物質(zhì)測定及在冷卻肉保鮮中的應(yīng)用

徐洪宇，詹壯壯，高永悅，張京京，董瑤，崔浩

（1.吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

（2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

冷卻肉是指嚴(yán)格執(zhí)行獸醫(yī)檢疫制度屠宰后的畜禽胴體迅速進(jìn)行冷卻處理，使胴體溫度（以后腿肉中心為測量點(diǎn)）在24 h內(nèi)降為0～4 ℃，并在后續(xù)加工、流通和銷售過程中始終保持0～4 ℃范圍內(nèi)的生鮮肉，它比冷凍肉具有更佳的口感與營養(yǎng)。在正常儲存條件下，肉類的腐敗主要是由微生物大量繁殖和氧化作用引起[1～4]。通過在冷卻肉上噴灑具有抑菌活性和抗氧化活性的物質(zhì)，可以起到良好的保鮮作用，從而延長貨架期，類似的研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Kim 等[5]將含有原花青素的可食性薄膜應(yīng)用到冷卻肉上，研究結(jié)果表明，可食性薄膜能抑制微生物繁殖和脂質(zhì)氧化，從而提高存儲期內(nèi)冷卻肉的質(zhì)量和延長保質(zhì)期。研究者將富含蝦青素的雨生紅球藻提取物，噴灑在冷卻肉上，可以起到很好的保鮮作用[6]。黑胡椒精油應(yīng)用到豬肉保鮮上也取得了類似的保鮮效果[7]。

甘薯（Ipomoea batatasL.），是世界第七大糧食作物，也是我國主要的糧食作物之一。甘薯的塊根和葉均可食用。目前主要利用甘薯嫩葉和柄烹飪菜肴、經(jīng)粗加工制成甘薯葉茶，以及制作甘薯葉濃縮蛋白粉等[8]。但大部分莖葉被作為廢棄物丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，而甘薯葉中活性成分在很大程度上被忽略。文獻(xiàn)報道，甘薯中含有豐富的酚類物質(zhì)[9～11]。這些酚類物質(zhì)除具有抗氧化活性和抑菌活性外，還具有抗誘變、抗癌、抗糖尿病、抗炎及抗病毒活性，具有促進(jìn)人體健康的生理和藥理功效[12]。

本研究以甘薯葉為原料，對甘薯葉粗提物的不同極性組分群（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相）中酚類物質(zhì)含量、抗氧化及抑菌活性進(jìn)行測定；并將活性強(qiáng)的組分群應(yīng)用到冷卻肉保鮮上；同時利用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器/電噴霧飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-diode array detector/electrospray ionization-time of fight-mass spectrometry，UPLC-DAD/ESI-TOF-MS）鑒別活性強(qiáng)的組分群中酚類成分。本研究旨在為甘薯葉的開發(fā)利用和深加工提供一定的理論參考和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯葉粉：品種為浙薯75，葉片于2016年10月中旬采自河南省新鄉(xiāng)市原陽縣。葉片采集后在90 ℃下殺青處理20 min，在60 ℃干燥箱中烘干，粉碎，過20目篩備用。

豬肉：新鮮豬肉購買于吉林市西紅柿超市，當(dāng)天宰殺。菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均由吉林化工學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2,2-二氮-雙（3-乙基并噻唑-6-磺酸）銨鹽（ABTS）、Folin-Ciocalteu試劑購自美國Sigma公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、1,1,3,3-四乙氧基丙烷氯化鐵、過硫酸鉀等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

XS105DU型分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)：AcquityTMultra型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Triple TOF 5600+型飛行時間質(zhì)譜（配有電噴霧離子源），美國AB SCIEX公司；Eppendorf minispan離心機(jī)，德國Eppendorf公司；PP-25型pH計(jì)，美國賽多利斯公司；HS-1300-U型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-30Sll型立式壓力蒸汽滅菌鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；SPX250B型生化培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制備

稱取甘薯葉粉500 g，加入80%的乙醇（料液比1:20，m/V），在60 ℃下提取3次，每次12 h，合并提取濾液，45 ℃旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮，得甘薯葉粗提物浸膏。浸膏用500 mL蒸餾水溶解成懸浮液，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5～8次，將各萃取（余）相分別濃縮、干燥，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，并將各相配制成所需濃度，用于總酚含量及活性測定。

1.3.2 總酚含量的測定

參考Turkmen等[13]的方法并略做改動。精確吸取40 μL樣品，加入0.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑混勻，靜置5 min后加入7.5%（m/V）碳酸鈉溶液0.5 mL，室溫下避光反應(yīng)2 h，725 nm下測定吸光值。以沒食子酸（0.1～5.0 mg/mL）作為標(biāo)品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量，以每克干樣品中含有的沒食子酸毫克數(shù)計(jì)，單位為mg/g。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 還原力測定

還原力的測定，采用Oyaizu[14]的方法。取1 mL不同濃度的粗提液，加入2.5 mL pH 6.6磷酸緩沖液，加入3 mL 1%鐵氰化鉀，50 ℃水浴10 min，冷卻，加入2.5 mL 10% TCA，振蕩搖勻，于3000 r/min，離心10 min。移取上清液2.5 mL，加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，室溫下避光反應(yīng)20 min，于700 nm處測定吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定，采用Brandwilliams等[15]的方法，略作修改。取1 mL不同濃度的粗提液，加入3 mL 0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，混勻后加入4.0 mL乙醇溶液，于室溫下避光反應(yīng)30 min后，517 nm下測定吸光度，以蒸餾水代替粗提液作為空白對照。按以下公式計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率。

注：式中Ac為空白樣品的吸光值，As為加入不同濃度樣品后的吸光值。

1.3.3.3 ABTS自由基清除率的測定

ABTS自由基清除率的測定，采用 Re等[16]的方法，并作適當(dāng)修改。將7 mmol/L的ABTS溶液10 mL，與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液10 mL混合，于室溫、陰暗條件下放置14～16 h，使用前用0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）將其稀釋至吸光度為 0.72～1.2，即得到ABTS自由基工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

取不同濃度的粗提液各1 mL，加入ABTS自由基工作液4 mL，反應(yīng)6 min后在波長734 nm處，測吸光度，用蒸餾水代替粗提液做空白試驗(yàn)。按以下公式計(jì)算樣品對ABTS自由基的清除率。

注：式中Ac為空白樣品的吸光值，As為加入不同濃度樣品后的吸光值。

1.3.4 抑菌活性測定

采用抑菌圈法進(jìn)行測定[17]。將平板培養(yǎng)皿底以“十”字形劃分成4等份，每一等分都標(biāo)明代碼。在超凈工作臺上用滅菌的移液管吸取0.1 mL的菌懸液于平板培養(yǎng)基上，并用刮鏟將菌懸液均勻涂布。將浸過樣品（100 mg/mL）的干燥濾紙片（直徑為6 mm）按一定的順序放置于含菌平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好后用直尺量取抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.5 豬肉保鮮試驗(yàn)

1.3.5.1 肉樣處理

在潔凈消毒的案板上將冷鮮豬里脊肉除去筋膜后，平均分成5組質(zhì)量為25±1 g的肉塊，分別用配制0.5%、1%的乙酸乙酯相、0.5%苯甲酸鈉和滅菌蒸餾水浸泡10 min，用保鮮膜密封，放入4 ℃冰箱中冷藏。在冷藏的0、3、6和9 d測定肉樣的pH值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物值（TBARS）、肌紅蛋白（MetMb%）含量、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）及菌落總數(shù)，每組重復(fù)3次。

1.3.5.2 pH值的測定

參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH值測定》進(jìn)行測定。

1.3.5.3 TBARS的測定

取10 g肉樣，用研缽研碎加入10 mL 20% TCA攪拌10 min常溫靜置1 h，3000 r/min離心10 min。移取上清液2 mL加入0.02 mol/L TBA 2 mL，沸水浴30 min，冷卻，在532 nm處測量吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TBA反應(yīng)性物質(zhì)（TBARS）值，并表示為mg、丙二醛（MDA）/kg樣品。

1.3.5.4 MetMb%含量測定

參照Krzywicki[18]方法，加以改進(jìn)。取5 g攪碎的肉樣置于50 mL已加有5 mL冰冷的磷酸緩沖液（pH值為6.8，40 mmol）的聚乙烯離心管中，在4 ℃，1000 r/min冷凍離心15 min，過濾上清液，測量700、572、525 nm的吸光值。MetMb百分含量按下式計(jì)算：

1.3.5.5 TVB-N的測定

參考GB/T 5009.44-2003方法進(jìn)行測定。

1.3.5.6 菌落數(shù)的測定

參照GB 4789.2-94方法進(jìn)行測定。結(jié)果以對數(shù)log cfu/g表示。

1.3.6 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS分析條件

色譜柱為安捷倫 ZORBAX-SBC18(100 mm×2.1 mm i.d., 3.5 μm)；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以0.1%甲酸乙腈為流動相B，線性梯度洗脫，0 min 5%B；2 min 5%B；15 min 30%B；25 min 50%B；33 min 95%B，流速為0.8 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜分析條件為，采用 UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀：正負(fù)離子掃描模式；掃描范圍：m/z100～1500；霧化氣：55 psi；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：600 ℃（正）550 ℃（負(fù)）；離子源電壓：5500 V（正）～4500 V（負(fù)）；一級掃描：去簇電壓：100 V；聚焦電壓：10 V；

二級掃描：使用TOF MS～Product Ion～I(xiàn)DA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為20、40和60 V，進(jìn)樣前，用 CDS泵做質(zhì)量軸校正，須使質(zhì)量軸誤差要小于2×10-6。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性組分群中酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性

圖1 總酚含量及抗氧化活性Fig.1 Total phenolic content and antioxidant activity

甘薯葉粗提物的各萃?。ㄓ啵┫嘀蟹宇愇镔|(zhì)含量及抗氧化活性（還原力、DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除率），如圖1a～d所示，乙酸乙酯相中酚類物質(zhì)含量（232.5 mg/g）極顯著高于正丁醇相（57.4 mg/g）和石油醚相（45.3 mg/g），而水相的酚類物質(zhì)含量（19.6 mg/g）顯著低于其它相，可見甘薯葉粗提物中所含的酚類物質(zhì)極性差異較大，酚類物質(zhì)種類較多，且主要集中于乙酸乙酯相中。質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL時，各萃?。ㄓ啵┫嗟倪€原力、DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除率均以乙酸乙酯相最強(qiáng)，其次為正丁醇相。

2.2 不同極性組分群抑菌活性

甘薯葉粗提物的各萃取（余）相：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相，在100 mg/mL濃度下對大腸桿菌、金黃色葡萄菌的抑菌效果，其抑菌活性以抑菌圈直徑大小衡量，如表1所示，4個極性組分群中，乙酸乙酯相的抑菌效果（11.8 mm、12.4 mm）強(qiáng)于正丁醇相（9.3 mm、10.3 mm）、石油醚相（8.6 mm、8.2 mm）及水相（8.3 mm、7.8 mm）?？梢姡适砣~中具于抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長的活性成分，主要集中在中等極性組分群的乙酸乙酯相中。

表1 不同極性組分群的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters of various polar group extracts in leaves

2.3 乙酸乙酯相對冷卻肉保鮮的研究

甘薯葉粗提物的乙酸乙酯相具有較強(qiáng)的抗氧化及抑菌活性，以0.5%、1%乙酸乙酯相及0.5%苯甲酸鈉浸泡冷卻肉后，觀察在存儲期內(nèi)，冷卻肉各項(xiàng)指標(biāo)的變化。

2.3.1 不同處理對貯存期內(nèi)冷卻肉pH值的影響

pH值是判定肉品新鮮度的重要指標(biāo)之一。文獻(xiàn)報道，新鮮肉浸出液的pH值在6.2以內(nèi)，當(dāng)肉腐敗時，微生物和酶分解肉中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一系列胺和氨類的堿性物質(zhì)，使肉的浸出液慢慢趨于堿性，也是2.3.4中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值上升的原因[19]。由圖2可知，在0～9 d內(nèi)，不同處理組pH值均呈上升趨勢，其中空白組上升趨勢最快，0.5%乙酸乙酯相處理組次之，1%乙酸乙酯相與 0.5%苯甲酸鈉處理組較慢。在第6 d時空白組的pH值超出了新鮮肉6.2的范圍，在第9 d 1%乙酸乙酯相處理組pH低于0.5%苯甲酸鈉處理組，且兩種處理組肉樣的pH值均保持在新鮮肉的標(biāo)準(zhǔn)。0.5%和1%乙酸乙酯相，能減緩肉樣pH值升高，這一規(guī)律與原花青素處理肉樣后實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[5,20]。黃師榮等[21]將九頭芥梅干菜粗提物的乙酸乙酯相浸泡冷卻肉后，在一定的貯存期內(nèi)，與空白組相比，冷卻肉pH值增長速率較慢，與本實(shí)驗(yàn)有類似結(jié)論。

圖2 不同處理組的冷卻肉在貯藏期間pH值的變化Fig.2 Changes of pH value of pork meat with different treatment groups during storage

2.3.2 不同處理對貯存期內(nèi)冷卻肉TBARS值的影響

圖3 不同處理組冷卻肉在貯藏期間TBARS值的變化Fig.3 Changes of TBARS value of pork meat with different treatment groups during storage

脂質(zhì)氧化降低肉的營養(yǎng)價值，以及肉制品的基本感官特性，導(dǎo)致風(fēng)味，質(zhì)地和顏色等改變[22]。TBARS值越大，表明在存儲過程中與此相關(guān)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的積累程度越強(qiáng)[23]。Kim等[24]報道，在4 ℃下保存7 d，TBARS值范圍在0.13～0.68 mg MDA/kg。

不同處理組冷卻肉在冷藏期間的TBARS值變化如圖3所示，在0～9 d，隨著貯藏時間的延長，各處理組的TBARS值變總體上升，即隨著貯藏時間的延長，冷卻肉的脂肪氧化程度不斷加強(qiáng)；1%乙酸乙酯相處理組與0.5%苯甲酸鈉處理組TBARS值上升緩慢且數(shù)值接近，冷卻肉經(jīng)過 1%乙酸乙酯相處理后能夠緩解脂質(zhì)氧化的程度。研究者發(fā)現(xiàn)，肉樣經(jīng)抗氧化劑處理后，其脂質(zhì)氧化程度呈劑量依賴性抑制[25,26]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)論一致。

2.3.3 不同處理對貯存期內(nèi)冷卻肉中MetMb%的影響

圖4 不同處理組冷卻肉在貯藏期間MetMb%值的變化Fig.4 Changes of MetMb% value of pork meat with different treatment groups during storage

屠宰后胴體顏色變化主要是由肌紅蛋白的變化引起，高鐵肌紅蛋白（MetMb）是肌紅蛋白氧化后的產(chǎn)物，呈現(xiàn)棕褐色，是鮮肉在儲藏過程中出現(xiàn)的一種不良現(xiàn)象。MetMb%可以作為評價鮮肉顏色的客觀指標(biāo)之一[27]。由圖 4所示，空白對照組在 4 ℃條件下，MetMb%隨時間延長均有較大的增加，其增加速度為空白組＞0.5%乙酸乙酯相處理組＞0.5%苯甲酸鈉處理組＞1%乙酸乙酯相處理組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 Zhang等[7]將黑胡椒精油處理冷卻肉后，其MetMb變化趨勢一致。有研究報道，細(xì)菌中的假單胞菌屬等能加速 MetMb的生成[28]。由此可知，因 1%乙酸乙酯相中含有豐富的酚類等具有抗氧化及抑菌活性物質(zhì)，從而延緩肌紅蛋白氧化成MetMb的速度。

2.3.4 不同處理對貯存期內(nèi)冷卻肉 TVB-N的影響

圖5 不同處理組冷卻肉在貯藏期間TVB-N值的變化Fig.5 Changes of TVB-N value of pork meat with different treatment groups during storage

TVB-N是評價鮮肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。隨著肉樣腐敗程度加深TVB-N值會隨之增加。GB 2707-1994豬肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：鮮肉TVB-N值≤20 mg/100 g。

圖5所示，隨著貯藏時間的延長，各處理組TVB-N值均呈上升趨勢，1%乙酸乙酯相處理組TVB-N值顯著低于空白對照組，空白對照組在第 6 d達(dá)到 15.1 mg/100 g，第9 d已達(dá)到22 mg/100 g左右，該值超過鮮肉的標(biāo)準(zhǔn)，而0.5%和1%乙酸乙酯相處理組及0.5%苯甲酸鈉處理組的 TVB-N值第 9 d時均小于 20 mg/100 g，冷卻肉維持在鮮肉范圍內(nèi)。Olafsdóttir等[29]研究報道，TVB-N值與腐敗菌群之間有顯著的相關(guān)性?？梢姡志钚晕镔|(zhì)的加入，可以延緩肉樣腐敗程度。

2.3.5 不同處理對貯存期內(nèi)冷卻肉菌落總數(shù)的影響

圖6 不同處理組冷卻肉在貯藏期間菌落數(shù)的變化Fig.6 Changes of colony total of pork meat with different treatment groups during storage

一般規(guī)定，一級新鮮肉菌落總數(shù)的對數(shù)值（log cfu/g）＜4，次級新鮮肉菌落總數(shù)的對數(shù)值為4～6，而變質(zhì)肉菌落總數(shù)的對數(shù)值＞6[19]。不同處理對貯存期內(nèi)冷卻肉菌落總數(shù)的影響，由圖6所示，實(shí)驗(yàn)前新鮮肉樣的菌落總數(shù)的對數(shù)值為3.5左右，貯藏一定時間后，不同處理組的菌落總數(shù)均有升高，空白對照組的菌落總數(shù)增加較大，在第6 d時肉樣接近變質(zhì)肉菌落總數(shù)的對數(shù)值上限6，而經(jīng)過1%乙酸乙酯相處理的菌落總數(shù)，在儲藏期增長緩慢，第9 d菌落總數(shù)的對數(shù)值與第0 d的值接近。酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌活性[30]，1%乙酸乙酯相可以抑制微生物的生長，從而延長冷卻肉的保質(zhì)期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Dai等[31]報道相似。

2.4 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS分析

甘薯葉粗提物的乙酸乙酯相，抗氧化及抑菌活性測定均強(qiáng)于其它萃?。ㄓ啵┫?，并將其應(yīng)用在豬肉保鮮上，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相中含有可以延長冷卻肉儲藏時間的活性成分，利用高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，在280 nm波長下紫外檢測，根據(jù)母離子峰、碎片離子、保留時間及紫外光譜圖等信息（圖7），結(jié)合參考文獻(xiàn)的報道，對其活性成分進(jìn)行分析、鑒定。共檢測出8種酚酸類化合物和1種黃酮類化合物（表2）。

圖7 乙酸乙酯相基峰色譜圖Fig.7 Chromatograms obtained by UPLC-DAD/ESI-TOF-MS analysis of ethyl acetate fraction at 280 nm

化合物 1出峰時間為 7.31 min，[M-H]－為353.0878，主要離子碎片為191.0560[奎寧酸-H]－，對照相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定為 1-CQA[9～11,32,33]?；衔?2出峰時間為8.43 min，[M-H]－為179.0341，通過比較一、二級質(zhì)譜，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-CO2-H]－等碎片離子，結(jié)構(gòu)中存甲氧基，化合物鑒定為咖啡酸?；衔?出峰時間為11.57 min，[M-H]－為463.0896，碎片離子中含有m/z301.0356、151.0034等碎片峰，則化合物3中含有槲皮素結(jié)構(gòu)，[M-Glc-H]－對應(yīng)的碎片離子m/z301.0356為失去1個質(zhì)量分?jǐn)?shù)為162（葡萄糖Glc）的中性碎片后生成的離子。Fabre等[34]表明，在黃酮苷類化合物的 MS/MS圖譜中，同時存在高強(qiáng)度的301.0356（Y0－）和 300.0274（[Y0-H]－）碎片離子，則表明糖連接在3-OH位。因此，化合物鑒定為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。化合物 4（12.28 min）、5（12.75 min）、6（13.33 min），母離子[M-H]－分別為 515.1191、515.1215、515.1209，分析MS/MS裂解圖譜及查閱文獻(xiàn)，它們?yōu)閐iCQA的同分異構(gòu)體。主要存在以下離子碎片353.0879[咖啡酰奎寧酸-H]－、191.0559[奎寧酸-H]－、179.0345[咖啡酸-H]－、173.0452[奎寧酸-2H2O-H]－、135.0455[咖啡酸-CO2-H]－。通過與 3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA的匹對，化合物4、5、6分別鑒定為3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA。同理，化合物 7、9鑒定為三咖啡酰奎尼酸異構(gòu)體Ⅰ、Ⅱ[9,35,36]。而化合物 8（15.00 min），[M-H]－為 529.1385，其主要碎片離子中含有m/z173.0455、193.0511、191.0561、155.0349，Gu等[37]認(rèn)為化合物結(jié)構(gòu)中，咖啡?；c4-OH相連，阿魏酰基與3-OH相連，確定化合物8為3-咖啡酰-4-阿魏酰奎寧酸。

表2 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS鑒定乙酸乙酯相中酚類物質(zhì)Table 2 Identification of the phenolic components in ethyl acetate fraction by UPLC-DAD/ESI-TOF-MS

3 結(jié)論

本研究以甘薯葉為材料，對其粗提物的萃?。ㄓ啵┫噙M(jìn)行總酚含量、抗氧化及抑菌活性測定，篩選出抗氧化及抑菌活性強(qiáng)的萃?。ㄓ啵┫啵M(jìn)行冷卻肉保鮮的研究，得到如下結(jié)論：

（1）不同萃取（余）相均含有酚類物質(zhì)，其中乙酸乙酯相中酚類物質(zhì)含量極顯著高于其它萃?。ㄓ啵┫?，為232.5 mg/g。

（2）四個不同極性組分群中乙酸乙酯相的抗氧化活性最強(qiáng)，并在一定濃度范圍內(nèi)強(qiáng)于 BHT的抗氧化活性。

（3）通過比較抑菌圈的大小來判斷各萃取（余）相對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，其由強(qiáng)到弱為，乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相＞水相。

（4）分析冷卻肉在4 ℃貯藏0～9 d的過程中pH值、TBARS值、MetMb%含量、TVB-N及菌落總數(shù)的變化結(jié)果。試驗(yàn)得到，1%乙酸乙酯相可以抑制脂肪氧化程度和微生物的生長，延長冷卻肉的保質(zhì)期。

（5）通過UPLC-MS/MS技術(shù)，從甘薯葉乙酸乙酯相中鑒定出9個主要酚類化合物，包括1-CQA、咖啡酸、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、三咖啡酰奎尼酸異構(gòu)體Ⅰ、3-咖啡酰-4-阿魏?？鼘幩?、三咖啡?？崴岙悩?gòu)體Ⅱ。