熒光素酶表達(dá)載體構(gòu)建及其在巴斯德畢赤酵母的表達(dá)

羅展浩，吳清平，張菊梅，丁郁，李程思，潘力，吳慧清

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）（3.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632）

螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase，F(xiàn)L)能在O2、Mg2+、ATP存在條件下，催化D-熒光素轉(zhuǎn)化為氧合熒光素并發(fā)出藍(lán)綠熒光（550～580 nm）[1]。ATP生物發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與 ATP的量成正比，通過一定階段恒定的ATP的量可以反映細(xì)菌等微生物的數(shù)量，該方法與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法有良好的相關(guān)性[2]，由于ATP生物發(fā)光具有高靈敏度、檢測(cè)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，該方法已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)各個(gè)領(lǐng)域。此前本實(shí)驗(yàn)室在熒光素酶的活體提取[3]、熒光素的化學(xué)合成[4]和微生物的生物發(fā)光快速檢測(cè)試劑性質(zhì)研究[5]上進(jìn)行較為系統(tǒng)的探索，開發(fā)了基于ATP生物發(fā)光的微生物快速檢測(cè)盒。面對(duì)食品生產(chǎn)過程微生物污染的問題，基于ATP生物發(fā)光的微生物快速檢測(cè)盒的研發(fā)愈發(fā)重要，因此通過不同表達(dá)系統(tǒng)大量快速生產(chǎn)熒光素酶可迎合市場(chǎng)需求。

1985年，De Wet[6]首次克隆北美螢火蟲熒光素酶，并在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，隨后各種熒光素酶被克隆和鑒定[1]。不少研究學(xué)者選擇大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)[7～9]，以研究酶的生產(chǎn)和應(yīng)用。但是通過大腸桿菌表達(dá)蛋白需要抗生素添加以保持遺傳性和存在著大量表達(dá)時(shí)會(huì)產(chǎn)生包涵體等問題。戎晶晶等[10]發(fā)現(xiàn)熒光素酶在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)形式主要為包涵體，夏蕾等[11]采用大腸桿菌 M15表達(dá)可溶蛋白，比活達(dá)到1.43×109RLU/mg，但產(chǎn)量只有0.68 mg/30 mL，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)相當(dāng)不利。

近年來由于熒光素酶的高靈敏度，單純作為報(bào)告基因，在真核系統(tǒng)中的表達(dá)如在裂殖酵母和畢赤酵母[12]、釀酒酵母[13,14]表達(dá)也有過報(bào)道，但是作為外源蛋白在畢赤酵母內(nèi)的表達(dá)和純化以及作為 ATP檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)試評(píng)估和應(yīng)用卻未見報(bào)道。畢赤酵母作為一種常用的高效生產(chǎn)蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，相比大腸桿菌具有遺傳穩(wěn)定、可進(jìn)行高密度培養(yǎng)、具有蛋白翻譯后糖基化修飾，蛋白能正確折疊，能進(jìn)行目標(biāo)蛋白的定向轉(zhuǎn)運(yùn)如胞外分泌等一系列優(yōu)點(diǎn)[15]。

本研究將北美螢火蟲（Photinus pyralis）熒光素酶基因luc克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，并進(jìn)行畢赤酵母的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在得到陽性轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)上進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，成功表達(dá)了熒光素酶。本研究首次實(shí)現(xiàn)了熒光素酶在畢赤酵母GS115體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)、純化及酶活鑒定的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

巴斯德畢赤酵母菌株GS115（P. pastorisGS115）和大腸桿菌DH5α（Escherichia coliDH5α）為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒 pPIC9K購自 Invitrogen公司，pGL2-control購自Promega公司。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

Pfu DNA聚合酶、AvrII、NotI、SacI限制酶、T4 DNA連接酶、Page Ruler prestained protein ladder購自賽默飛世爾科技公司；DNA marker、氨芐青霉素、遺傳霉素（G418）、購自上海生工生物工程公司；鼠抗熒光素酶抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗鼠IgG抗體購自全式金公司；質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA膠回收試劑盒、普通DNA純化試劑盒均購自天根生化科技公司；DEAE Sepharose FF層析柱、Superdex 75pg購自純?cè)锕?；超濾離心管、luminol購自Merck Millipore公司；D-熒光素為本實(shí)驗(yàn)室制備；其他試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、MD培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基按照Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)制備。

1.1.3 儀器設(shè)備

蛋白純化儀 AKTA start，GE Healthcare公司；Multiporator多功能電轉(zhuǎn)移電融合儀，Eppendorf公司；Milli-Q純水機(jī)，Millipore；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī)，Beckman公司；Centrifuge 5424小型離心機(jī)，Eppendorf公司；Nexus GSX1梯度PCR儀，eppendorf公司；VC-505超聲波細(xì)胞破碎儀，Sonics公司；Chemidoc MP全能型成像系統(tǒng)，Bio-rad公司；Glomax 20/20 luminometer熒光檢測(cè)儀，Promega公司。

1.1.4 引物

本文所用的引物如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 北美螢火蟲熒光素酶基因luc的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

從NCBI（GenBank：X65324.2）獲取北美螢火蟲熒光素酶基因序列l(wèi)uc，設(shè)計(jì)PCR引物見上表1，由華大基因合成。以pGL2-control為模板，引物luc-F、luc-R，PCR擴(kuò)增獲得熒光素酶全長(zhǎng)基因luc。反應(yīng)條件：96 ℃ 10 min；96 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物純化后，與質(zhì)粒pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α，感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[16]進(jìn)行。轉(zhuǎn)化后在 LB固體培養(yǎng)基（Amp終濃度為100 μg/mL），挑選陽性轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并送華大基因公司測(cè)序。構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pPIC9K-luc。

表1 熒光素酶基因擴(kuò)增與驗(yàn)證的PCR引物Table 1 PCR primers for luciferase gene amplification and confirmation

1.2.2 重組菌 GS115/pPIC9K-luc的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的篩選

重組質(zhì)粒pPIC9K-luc經(jīng)SacI線性化后，用普通DNA純化試劑盒純化，電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入1 mol/L冰冷山梨醇，低速振蕩培養(yǎng)1 h后，涂布MD選擇性固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。酵母感受態(tài)細(xì)胞制備參考文獻(xiàn)[17]。

將單菌落轉(zhuǎn)移到含0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL遺傳霉素G418的YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～6 d，篩選能在高濃度遺傳霉素G418的YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落。單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，用煮-凍-煮[18]方法提取基因組作為擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物為α-factor和3’AOX1，反應(yīng)條件同上。同樣的方法將空質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.3 重組菌P.pastorisGS115/pPIC9K-luc的Mut+、MutS表型鑒定

將篩選所得的轉(zhuǎn)化子均影印到MD和MM培養(yǎng)基，同時(shí)能在兩種培養(yǎng)基中良好快速生長(zhǎng)的為 Mut+表型；在前者快速生長(zhǎng)但在MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢的為MutS。

1.2.4 重組P.pastorisGS115/pPIC9K-luc甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組的P.pastoris單菌落接種到10 mL液體BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)約24 h作為種子液。取1 mL種子液接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h至OD600約為3～6。4 ℃，5000 r/min離心5 min，沉淀重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基（含2%甲醇），進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，20 ℃、200 r/min，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為2%，同時(shí)每12 h取樣，直接測(cè)量發(fā)酵液的酶活性，96 h后最終收獲發(fā)酵液。

1.2.5 發(fā)酵粗酶液的提取

50 mL發(fā)酵液5000 r/min 離心5 min得到上清粗酶液Ⅰ，沉淀用 2 mL熒光素酶溶解液（0.2 mol/L Tris-HCl，5 mmol/L Mg2+，1 mmol/L EDTA，pH 7.8）沖洗，離心后得到上清粗酶液Ⅱ。菌體沉淀純水洗滌數(shù)次后加入 2 mL酵母裂解緩沖液（0.2 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L PMSF，5 mmol/L EDTA，10%甘油，pH 8.0），加入直徑為425 μm～600 μm 玻璃珠進(jìn)行渦旋破碎12次（30 s渦旋，30 s冰上放置為1次）后，冰浴超聲破碎8 min（5 son，5 soff），12000 r/min離心10 min，得到胞內(nèi)酶清液Ⅲ。

1.2.6 重組菌 GS115/pPIC9K-luc表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和western blotting鑒定

三種粗酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，加入SDS proteinloading buffer沸水浴5 min，短暫離心作電泳上樣樣品。同時(shí)GS115/pPIC9K全菌體作為陰性對(duì)照，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（5%濃縮膠，12%分離膠）分析。電泳過后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，分別用鼠抗熒光素酶抗體作為一抗孵育40 min，以辣根過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體為二抗孵育 20 min后，H2O2與luminol混合為反應(yīng)底物顯影，進(jìn)行蛋白印跡分析。

1.2.7 粗酶液的酶活測(cè)定

20 μL甘氨酸緩沖液（GDB）（25 mmol/L甘氨酰甘氨酸二肽，5 mmol/L Mg2+，1 mmol/L EDTA-Na2，0.4%α-環(huán)糊精，0.15%二乙氨乙基葡聚糖，pH 7.2），10 μL 1 mmol/L D-熒光素，10 μL 1 mmol/L ATP 溶液組成的反應(yīng)液，加入10 μL粗酶液開始生物發(fā)光反應(yīng)，立即放入熒光檢測(cè)儀中，integrate time 4 s模式測(cè)定熒光強(qiáng)度室溫下測(cè)定，發(fā)光強(qiáng)度以熒光檢測(cè)儀的讀數(shù)值-相對(duì)發(fā)光單位RLU（Relative Light Units）表示酶活。

若測(cè)試粗酶液本底熒光發(fā)光強(qiáng)度，將反應(yīng)體系中的10 μL ATP溶液換成超純水，以評(píng)估細(xì)胞殘留ATP對(duì)發(fā)光的影響程度。

1.2.8 粗酶液中蛋白的純化

50 mL誘導(dǎo)表達(dá)96 h的培養(yǎng)液，離心取沉淀，加入2 mL酵母裂解緩沖液，玻璃珠與超聲破碎后，離心取上清液作為粗酶液。粗酶液用超濾離心管（MWCO 50 ku）進(jìn)行超濾并且更換緩沖液NTE（20 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 7.8）。蛋白濃縮液經(jīng)DEAE-FF陰離子交換柱進(jìn)行第二步純化，用含0～1 mol/L NaCl的NTE緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集蛋白峰。后經(jīng)Superdex 75 pg分子篩凝膠層析第三步純化，NTE洗脫收集蛋白峰。最后用SDS-PAGE檢驗(yàn)純化效果，并對(duì)相應(yīng)粗酶液進(jìn)行酶活鑒定。

1.2.9 ATP濃度生物發(fā)光檢測(cè)

將酶稀釋到 0.1～0.5 mg/mL，采用如下體系進(jìn)行ATP 生物發(fā)光檢測(cè)：20 μL GDB，20 μL 酶液，5 μL 1 mmol/L熒光素作為反應(yīng)體系。分別加入 5 μL 1×10-6～1×10-12mol/L ATP 后，立即放入熒光檢測(cè)儀中，integrate time 4 s模式測(cè)定熒光強(qiáng)度，室溫下進(jìn)行測(cè)定。取發(fā)光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)和 ATP濃度的對(duì)數(shù)作熒光發(fā)光值-ATP濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1×10-6～1×10-10mol/L范圍內(nèi)的濃度已知的ATP樣品作為待測(cè)ATP樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)待測(cè)樣品ATP濃度，并對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有酶活性測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，圖表采用Excel 2010和Origin 8.0數(shù)據(jù)處理軟件加工處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 熒光素酶基因的克隆與驗(yàn)證

根據(jù)方法1.2.1構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPIC9K-luc如圖 1（a），熒光素酶基因luc插入到 5’AOX1與3’AOX1（TT）之間的表達(dá)框內(nèi)。用NotI與AvrII雙酶切pPIC9K-luc驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，酶切結(jié)果如圖1（b），得到兩條明顯條帶：熒光素酶基因luc（1653 bp）與線性化質(zhì)粒pPIC9K（9273 bp），測(cè)序結(jié)果也驗(yàn)證熒光素酶基因序列正確，表達(dá)載體pPIC9K-luc構(gòu)建成功。

2.1.2 重組菌的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的篩選

限制酶SacI酶切得到線性化的重組載體pPIC9K-luc，電轉(zhuǎn)化山梨醇制備的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞P. pastorisGS115，在缺乏組氨酸的MD篩選平板上初篩一批轉(zhuǎn)化子41個(gè)，并且進(jìn)一步復(fù)篩，挑選了最高能在含1 mg/mL G418的YPD平板上生長(zhǎng)的菌落2個(gè)。G418篩選濃度的高低反映著整合到染色體組目的基因的拷貝數(shù)目，劑量效應(yīng)被認(rèn)為影響異源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中最重要的因素，基因拷貝數(shù)越高，表達(dá)量越大[19]。本文未能篩選到抗2 mg/mL G418的高拷貝轉(zhuǎn)化子，較大可能因?yàn)槌鹾Y的轉(zhuǎn)化子數(shù)目遠(yuǎn)不足，只有41個(gè)，一般His+轉(zhuǎn)化子中自發(fā)多拷貝整合的概率為1～10%。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-luc的構(gòu)建（a）和重組質(zhì)粒pPIC9K-luc的酶切鑒定（b）Fig.1 Construction of recombinant plasmid pPIC9K-luc (a) and gel electrophoresis of pPIC9K-luc digested with restriction enzymes(b)

圖2 重組酵母GS115/pPIC9K-luc的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR identification of recombinant P. pastoris GS115/pPIC9K-luc

本文復(fù)篩得到的抗1 mg/mL G418的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步提取的酵母染色體組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證如圖2所示。出現(xiàn)接近2 kb的條帶，與α-factor和熒光素酶融合的基因片段（約1.9 kb）相吻合，證明重組載體的目的基因成功重組插入到核染色體組。篩選得到的 2個(gè)菌株編號(hào)為 GS115/pPIC9K-1，GS115/pPIC9K-2，經(jīng)驗(yàn)證均為Mut+表型。同時(shí)空載體轉(zhuǎn)化的酵母命名為GS115/pPIC9K。

2.2 熒光素酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

2.2.1 發(fā)酵液與上清液的酶活初步測(cè)定

圖3 發(fā)酵液酶活測(cè)定Fig.3 The enzyme activity assay of fermentation broth

每12 h取樣保存于-20 ℃冰箱的發(fā)酵液樣品作為粗酶液，取10 μL加入到熒光素酶發(fā)光反應(yīng)液中進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)光強(qiáng)度如圖3所示，發(fā)酵時(shí)間在72 h內(nèi)，兩株 GS115/pPIC9K-luc的發(fā)酵液的酶活性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，熒光素酶逐漸累積。在72 h時(shí)，GS115/pPIC9K-luc1發(fā)酵的酶淸液達(dá)到峰值為1.25×108RLU/mL。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液酶活迅速降低，96 h僅剩下40.7%最高酶活：5.09×107RLU/mL。這種酶活迅速降低的原因可能是蛋白酶水解所致。該結(jié)果也為日后的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取最佳發(fā)酵時(shí)間提供了參考。GS115/pPIC9K-luc2菌株的發(fā)酵所得酶酶活變化趨勢(shì)和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的絕對(duì)酶活與菌株1相差不大。

圖4 上清粗酶液酶活測(cè)定Fig.4 The enzyme activity assay of supernatants

誘導(dǎo)表達(dá)96 h最終收獲的發(fā)酵液，經(jīng)過離心、洗滌沉淀、破碎細(xì)胞再離心后得到3份上清粗酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，同樣進(jìn)行酶活測(cè)定。如圖4所示，發(fā)酵液上清即粗酶液Ⅰ的發(fā)光活性較低為1.45×106RLU/mL；上清粗酶液Ⅱ的酶活約為前者的 20倍，為 3.21×107RLU/mL；酵母裂解的胞內(nèi)粗酶液Ⅲ的酶活最高，達(dá)到1.58×109RLU/mL。這組結(jié)果表明酵母表達(dá)的熒光素酶沒有完全釋放到胞外，大部分保留細(xì)胞內(nèi)。

本研究構(gòu)建了畢赤酵母-熒光素酶表達(dá)株，期望在α因子分泌肽的引導(dǎo)下進(jìn)行胞外表達(dá)熒光素酶[20]，但絕大多數(shù)熒光素酶未能有效分泌到胞外。與Yasuo等[21]在煙草植物真核細(xì)胞表達(dá)FL，只在胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)酶發(fā)光活性的結(jié)果一致。某些研究[22～24]表明，熒光素酶羧基端的絲氨酸-賴氨酸-亮氨酸三肽(SKL過氧化物酶體定位序列)，能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體中，導(dǎo)致熒光素酶分泌胞外分泌量較低。但胞外淸液粗酶活也達(dá)到1.45×106RLU/mL，表明熒光素酶轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體的途徑可能被過表達(dá)的熒光素酶飽和，而逃逸進(jìn)入外泌途徑。有報(bào)道證明，發(fā)酵過程添加酸水解酪蛋白能夠有效增加蛋白的表達(dá)量[25]，表面活性劑如吐溫-20的添加能顯著增加蛋白的分泌量[26]，這些方面都為提高熒光素酶表達(dá)量和促進(jìn)胞外分泌提供可能，也指明了后續(xù)研究工作的方向。三種粗酶液的酶活測(cè)試試驗(yàn)中，測(cè)試體系不外加ATP，以純水代替，觀察粗酶液中殘留的細(xì)胞ATP對(duì)發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生的影響，通過本底發(fā)光值表示。測(cè)試體系外加ATP的發(fā)光強(qiáng)度作為非本底值，發(fā)現(xiàn)前者為后者的5%～6%，表明發(fā)酵液和胞內(nèi)破碎粗酶液仍然含有一定量酵母細(xì)胞產(chǎn)生的ATP殘留，對(duì)表達(dá)蛋白的酶活測(cè)定造成一定影響，在處理上作相應(yīng)扣除以反映酶液的真實(shí)酶活水平。

2.2.2 重組菌 GS115/pPIC9K-luc表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳以及western blot分析

圖5 重組菌GS115/pPIC9K-luc表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of protein expressed by recombinant GS115/pPIC9K-luc

將上清粗酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。結(jié)合western blot分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的熒光素酶分子量略大于70 ku（高于理論預(yù)測(cè)大小62 ku），且大部分存在于細(xì)胞內(nèi)而非胞外。在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的熒光素酶均為60 ku[8]，推測(cè)可能有潛在糖基化發(fā)生。用 NetNGlyc 1.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對(duì)重組蛋白潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，導(dǎo)致酶實(shí)際分子量較其理論分子量大。糖基化作為畢赤酵母系統(tǒng)最常見的蛋白翻譯后加工形式，不同位點(diǎn)的糖基化發(fā)揮不同作用[27]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，N-糖基化能顯著提高酶的穩(wěn)定性、分泌性和活性[28]。Yang[29]在畢赤酵母表達(dá)的中華根霉脂肪酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分位點(diǎn)糖基化可提高分泌性，部分可提高酶的活性和穩(wěn)定性。Chang[30]通過表達(dá)特定糖基化位點(diǎn)缺失的煙曲霉木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)糖基化的缺失導(dǎo)致酶熱穩(wěn)定性顯著降低。同理，熒光素酶的糖基化亦為提高其熱穩(wěn)定性和酶活性提供了可能，對(duì)提高熒光素酶的可利用程度是有幫助的SDS-PAGE分析中上清粗酶液Ⅲ的熒光素酶蛋白條帶較為明顯，而上清粗酶液Ⅰ沒有顯示相應(yīng)條帶，這與三份樣品的酶活分析結(jié)果相一致，再次證明表達(dá)的蛋白大部分存在于細(xì)胞內(nèi)。

圖6 重組菌GS115/pPIC9K-luc表達(dá)產(chǎn)物蛋白印跡分析Fig.6 Western blotting analysis of protein expressed by recombinant GS115/pPIC9K-luc

Western blot結(jié)果如圖6所示，胞外、胞內(nèi)粗酶存在其他微弱的雜帶，空白對(duì)照不存在任何條帶出現(xiàn)，而泳道4更在30 ku出現(xiàn)較深雜帶，這表示蛋白受到不同程度的降解，造成降解片段與抗體的結(jié)合顯現(xiàn)條帶，與圖3所示結(jié)果吻合。研究表明[31～34]，低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)利于提高蛋白穩(wěn)定性，降低蛋白酶濃度與活力，增加細(xì)胞的存活率。20 ℃誘導(dǎo)時(shí)，AOX1酶及與甲醇誘導(dǎo)過程中能量代謝途徑相關(guān)酶的活性比 30 ℃誘導(dǎo)時(shí)的都要高[35]。因此選用 20 ℃作為誘導(dǎo)溫度，一方面能夠較好地利用碳源，另一方面盡可能降低蛋白酶酶活，提高酶活性表達(dá)。前期實(shí)驗(yàn)工作確實(shí)發(fā)現(xiàn)30 ℃表達(dá)的胞外熒光素酶酶活只有20 ℃的5%～17%。20 ℃的發(fā)酵溫度有一定的表達(dá)優(yōu)勢(shì)，但結(jié)果表明20 ℃還不足以完全抑制蛋白酶的水解作用。

2.2.3 熒光素酶的純化

圖7 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis for each step of purified products

50 mL菌液培養(yǎng)所得的菌體，直接破碎得到粗酶液經(jīng)過超濾、DEAE陰離子交換層析和分子篩凝膠層析，得到2.4 mg蛋白，其比活達(dá)到7.0×108RLU/mg，純化倍數(shù)達(dá)到19.3，如表2，與夏蕾[8]報(bào)道的在大腸桿菌純化的比活為1.43×109RLU/mg，純化倍數(shù)為10.6，比活上并不突出，但是在酶的回收上有著優(yōu)勢(shì)，未來可通過改變發(fā)酵條件和高密度發(fā)酵技術(shù)，在大規(guī)模生產(chǎn)上取得突破。如圖7所示，純化后的熒光素酶的電泳圖出現(xiàn)兩條大小略大于70 ku的條帶，為不同程度糖基化的熒光素酶。螢火蟲熒光素酶作為一種來源于真核細(xì)胞的蛋白，適度的糖基化更接近于螢火蟲體內(nèi)的存在形式，對(duì)酶活穩(wěn)定存在一定作用。因此在畢赤酵母中表達(dá)糖基化的酶是大腸桿菌系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)的，針對(duì)該系統(tǒng)表達(dá)的熒光素酶，未來可以就糖基化對(duì)熒光素酶所產(chǎn)生的效應(yīng)作進(jìn)一步的研究。

Verma[12]曾在比較真核啟動(dòng)子的活性中，使用AOX1啟動(dòng)子在裂殖酵母表達(dá)熒光素酶，Leskinen[36]、Ainsworth[37]也同樣就釀酒酵母系統(tǒng)中啟動(dòng)子活性檢測(cè)的研究中使用過熒光素酶，但均沒有在純化和活性上作過多的研究。本研究初次在畢赤酵母中以熒光素酶的異源表達(dá)純化、應(yīng)用為目的，獲得的熒光素酶達(dá)到預(yù)期的產(chǎn)量和活性。

表2 不同純化步驟后重組酵母表達(dá)的熒光素酶的特性分析Table 2 The characteristics of luciferase expressed by recombinant P.pastoris after different purification steps

2.3 ATP濃度生物發(fā)光檢測(cè)

圖8 ATP生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of ATP assay

采用本研究的熒光素酶進(jìn)行ATP生物發(fā)光反應(yīng)，繪制 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)本研究的酶在 10-6～10-10mol/L存在良好線性關(guān)系，y=0.3227x+0.641，R2=0.9979（圖 8）。選取線性范圍內(nèi)的三個(gè)濃度 ATP，配制成ATP溶液作為待測(cè)樣品，進(jìn)行ATP濃度檢測(cè)來評(píng)價(jià)酶的實(shí)用效果。具體ATP測(cè)量結(jié)果如下表3。

表3 純化后熒光素酶對(duì)ATP樣品的生物發(fā)光檢測(cè)Table 3 Biological luminescence detection for ATP solution sample by purified luciferase

上述結(jié)果表明，純化的熒光素酶能夠較好地檢測(cè)ATP并反映其真實(shí)濃度。

3 結(jié)論

3.1 熒光素酶的一個(gè)重要應(yīng)用就是通過檢測(cè)微量ATP從而對(duì)微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，與傳統(tǒng)的瓊脂平板培養(yǎng)法相比，有著快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度、可自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)[38]，如果采用免疫磁珠對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使用含有熒光素酶的微生物ATP快速檢測(cè)盒，則可對(duì)食源性致病微生物進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠監(jiān)測(cè)、預(yù)防食品加工過程食源性致病微生物的污染。

3.2 相比起大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：外源基因的遺傳性能穩(wěn)定、可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾，能夠進(jìn)行高密度培養(yǎng)發(fā)酵。本研究構(gòu)建了熒光素酶的表達(dá)載體pPIC9K-luc，運(yùn)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)熒光素酶。但是未能使酶進(jìn)行有效的分泌，誘導(dǎo)表達(dá) 96 h后胞內(nèi)酶活達(dá)到了 1.58×109RLU/mL。對(duì)胞內(nèi)酶進(jìn)行了有效的陰離子層析和分子篩凝膠層析純化，獲得單一的熒光素酶，比活為7.0×108RLU/mg，純化倍數(shù)達(dá)到19.3倍，產(chǎn)量為48mg/L。

3.3 本研究利用真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母來表達(dá)熒光素酶，為商業(yè)化生產(chǎn)熒光素酶提供了理論依據(jù)。未來可通過過氧化氫酶體定位序列的缺失和發(fā)酵條件的優(yōu)化，增加異源表達(dá)熒光素酶的胞外分泌量以簡(jiǎn)化下游純化步驟，使其更加適應(yīng)酶的工業(yè)化生產(chǎn)要求。