蒙藥松蘿飲片的生藥學(xué)鑒定及含量測定研究

薩出拉　那生桑

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010110;　2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010110)

松蘿為松蘿科植物長松蘿Usnea longissima Ach.或節(jié)松蘿Usnea diffracta Vain.的絲狀體。是蒙醫(yī)常用藥材，蒙藥名為斯日古德、阿拉坦-烏塔斯-烏布斯，以全草入藥[1]。蒙藥松蘿味苦，性涼，效鈍、軟、柔；具有清熱、解毒之功效，主治毒癥，腹鳴，泄瀉，腸熱，筋腱疼痛，肺膿瘍等[2]。蒙醫(yī)藥多部文獻均有記載。如《認藥白晶鑒》記：“纏繞于松樹，生于草灘溝岸灌叢中”?！稛o誤蒙藥鑒》則曰：“該條所植物形狀似菟絲子，但菟絲子為有花植物，不符《認藥白晶鑒》所述形態(tài)特征”該條所植物形狀似菟絲子，但菟絲子為有花植物，不符《認藥白晶鑒》所述形態(tài)特征?！吨袊t(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)》、《蒙藥志》等近代蒙醫(yī)藥書籍均認為松蘿為正品，故認定歷代蒙醫(yī)藥文獻所載的斯日古德即阿拉坦-烏塔斯-烏布斯為我們所說的松蘿[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛等作用[6-9]，其主要含有巴爾巴地衣酸地弗地衣酸 、松蘿酸 、地衣聚糖 、長松蘿含有多糖 、扁枝衣酸乙酯等[10]。本文對藥材的性狀及纖維特征進行考證，并對其所含的松蘿酸進行了含量測定，從而為蒙藥松蘿飲片的生藥學(xué)鑒定及含量測定提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1　實驗材料

1.1儀器設(shè)備LC-20A型島津高效液相色譜儀(日本)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；AB135-S型電子天平(METTLER TOLEDO Made in Switerland)；JA5003N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；ZF-I型三用紫外分析儀器(上海古村電光儀器廠)；薄層板為自制硅膠GF254板。

1.2試劑與試藥松蘿(市場購置，批號20151012和20151227；河北購置，批號20160715)經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為節(jié)松蘿Usnea diffracta Vain.干燥的全草。松蘿酸(批號15120506，含量>98%，購自北京中科儀友化工技術(shù)研究院)。乙腈、甲醇為色譜純；超純水；其他試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1藥材定性分析

2.1.1性狀鑒別本品為地衣體絲狀，較粗壯，淡灰綠色或淡黃棕色。枝體表面有多數(shù)環(huán)狀裂溝。橫斷面可見中央有線狀強韌性的重軸，具彈性，由菌絲組成；其外為藻環(huán)，常有環(huán)狀溝紋分離成短筒狀。

2.1.2顯微鑒別本品粉末灰綠色。菌絲線狀成束，無色，直徑6～12μm。藻細胞類圓形成群，含葉綠體，呈綠色，直徑8～15μm。如圖1。不同批次樣品均顯此特征，故將此特征作為蒙藥松蘿飲片的粉末特征。

2.1.3薄層鑒別取松蘿粉碎(過5號篩)或松蘿粉5.0g，置索氏提取器內(nèi)，加三氯甲烷適量，加熱回流提取4h，提取液濃縮后，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取松蘿酸對照品，用三氯甲烷配制成每1mL含1.0mg制成對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版通則0502)試驗，吸取上述2種溶液各5μL，分別點于同一含羧甲基纖維素鈉的硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-苯-冰乙酸(7:2:1)為展開劑，飽和1h展開，取出，熱風(fēng)吹干，置紫外燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。如圖2。不同批次樣品均有此特征，故將本方法作為蒙藥松蘿飲片薄層鑒別方法。

2.2檢查由于本品為全草類藥材，在采集和運輸過程中易帶入泥沙、塵土等非藥用部分，同時容易受到干燥或潮濕環(huán)境的影響，故對藥材的水分、總灰分進行限度檢查，以控制藥材的純度。

2.2.1水分照《中國藥典》(2015版四部通則0832 第二法)進行水分測定。

取3批樣品，每批約2～5g，平鋪于干燥置至恒重的扁型稱量瓶中，厚度不超過5mm,疏松供試品不超過10mm，精密稱定，開啟瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計算樣品的含水量。結(jié)果表明，3批樣品水分含量在9.71%～9.82% ，均值為9.76% ，故規(guī)定蒙藥材松蘿水分含量不得過11%。結(jié)果如表1。

表1　松蘿水分含量測定

2.2.2灰分照《中國藥典》(2015版四部通則2302)進行總灰分測定。

取三批樣品，每批約5g(通過2號篩)，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量，緩緩熾熱，至完全炭化，逐漸升溫至500～600℃，使完全灰化并至恒重，根據(jù)殘渣量，計算樣品種總灰分的含量0.972(%)。結(jié)果表明，3批樣品總灰分含量在0.966%～0.982%之間，平均值為0.972；故規(guī)定蒙藥材松蘿總灰分不得過1.2%，結(jié)果如表2。

表2　松蘿總灰分含量測定表

2.3浸出物的測定照醇溶性浸出物測定法《中國藥典》(2015年版 四部通則2201)熱浸法測定，用乙醇作溶劑。

3批樣品的乙醇浸出物在4.19%～4.58%之間，平均值為4.42%。故規(guī)定蒙藥松蘿醇溶性浸出物(熱浸法)不得少于3.50% ，結(jié)果如表3。

表3　松蘿醇溶性浸出物測定結(jié)果

2.4含量測定松蘿中含有多種有效成分，如松蘿酸(usnic acid)、地弗地衣酸(diffractaic acid)、巴爾巴地衣酸、脂肪酸、多糖等化合物。松蘿酸又名地衣酸，具有旋光性，在地衣中發(fā)現(xiàn)(+)及(-)2中形式[11]。松蘿酸易溶于丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷甲醇混合液中[10]，還有文獻報到以甲醇為溶劑，取得了較好的提取效果[12]。松蘿因此本實驗選擇了色譜甲醇從松蘿中提取松蘿酸，比此方法提取量最多且操作簡便。

2.4.1色譜條件Packed Column 5C18分析住(4.6×250mm ,5μm)；柱溫30℃；檢測波長：254nm；進樣量：10μL；流動相：乙腈(A), 5%冰乙酸 (B)，分析柱流動相比例：A:B=78:22；流速：1mL/min。

流動相的選擇：對流動相甲醇-水(85:15)、乙腈：25%乙酸溶液(78:22)進行實驗篩選。結(jié)果表明，以乙腈：25%乙酸溶液(78:22)為流動相色譜峰形理想、分離度好。但有些拖尾，因此考察了不同濃度的乙酸溶液(25%、20%、10%、5%、1%乙酸溶液)，發(fā)現(xiàn)流動相以乙腈：5%乙酸溶液(78:22)時不拖尾、保留時間短、峰純度好，故選擇該流動相。

2.4.2溶液的制備

2.4.2.1供試品溶液的制備供試品提取溶液的選擇：分別做了乙酸乙酯熱回流提取、丙酮超聲提取及色譜甲醇超聲提取，結(jié)果表明，色譜甲醇提取最為有效的溶劑，此方法提取量最多且操作簡便。

取本品粉末(過5號篩)約0.1g，精密稱定，置于具塞100mL錐形瓶中，精密加入60mL色譜甲醇，密塞，超聲處理(功率300W，頻率40kHz)20min，放冷5min，過濾，取續(xù)濾液即可。

2.4.2.2對照品溶液的制備取松蘿酸對照品適量，精密稱定，加色譜甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，搖勻，即可。

2.4.3系統(tǒng)適用性試驗在上述色譜條件下精密吸取對照品溶液10μL,注入液相色譜儀，記錄峰面積。松蘿酸的濃度為(0.5mg/mL)。松蘿酸與雜質(zhì)峰分離效果較好，理論塔數(shù)以松蘿酸峰計算為3000，實驗結(jié)果見圖3～6。

2.4.4線性關(guān)系考察取松蘿對照品，制成濃度分別30、40、50、100、150、250μg/mL的溶液，依次進樣10μL，記錄峰面積，以對照品的濃(μg/mL)峰面積縱坐標，可見松蘿酸在30-250μg/mL范圍內(nèi)，得到松蘿酸線性回歸方程Y=12938X-237883，R2=0.9999，線性關(guān)系良好，見圖7。

2.4.5精密度試驗取樣品溶液進樣10μL，記錄峰面積，重復(fù)操作5次，記錄峰面積.結(jié)果RSD≤2.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.6重復(fù)性試驗取5份同一供試品溶液(批號：20151227)，依次各取溶液10μL進樣(過濾后)，記錄峰面積，結(jié)果RSD≤2.18%，表明本法重復(fù)性較好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗取同一批次樣品，依次在0h、2h、4h、8h、10h、12h下取溶液(過濾后)進樣10μL，記錄峰面積，以峰面積計算RSD。結(jié)果 RSD≤3.81%，表明供試品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8加樣回收試驗考察精密稱取供試品溶液6份(0.025g)，分別置于,6個相同規(guī)格的容量瓶中，各加入15mL色譜甲醇，再精密加入松蘿酸對照品，超聲20min，放冷，過濾，按含量測定方法精密吸取10μL進樣，記錄峰面積，計算出含量、回收率以及RSD。結(jié)果如表4,平均回收率為100.8 %，RSD為1.15% ,表明本方法準確可靠。

表3　松蘿醇溶性浸出物測定結(jié)果

2.4.9樣品含量測定精密吸取不同批次樣品的供試品溶液各3份，每份注入10μL,按上述同樣條件測定。結(jié)果如表5，松蘿酸含量在7.23%～7.49 %之間，平均含量為7.44%，故規(guī)定松蘿中松蘿酸的含量不得少于6.0%。

表5　松蘿含量測定結(jié)果(n=3)

3　討論

在松蘿酸含量測定研究中對流動相和供試品提取溶液進行了平行對照選擇，結(jié)果：流動相以乙腈：5%乙酸溶液(78:22)時不拖尾、保留時間短、峰純度好，故選擇該流動相。供試品提取以色譜甲醇提取最為有效的溶劑，此方法提取量最多且操作簡便。

松蘿作為蒙醫(yī)常用的藥材，其飲片入味于多種復(fù)方制劑，雖然關(guān)于其質(zhì)量研究報道，但在蒙醫(yī)藥飲片領(lǐng)域的質(zhì)量標準研究尚未報道。并且節(jié)松蘿研究至今空白，因此本實驗主要研究的是節(jié)松蘿。本研究參考《中國藥典》(2015年版一部)，結(jié)合松蘿蒙醫(yī)藥用藥特點，從飲片的性狀、顯微、水分、總灰分、浸出物、松蘿酸含量等方面進行了研究，并初步擬定了其質(zhì)量控制范圍，建立了較為完善的質(zhì)量標準草案，為保證松蘿飲片及其復(fù)方制劑的臨床療效的均一性和穩(wěn)定性提供了較為完善的質(zhì)量標準。