人參四物湯預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制探討

張世亮,續(xù)自鳳,房美

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250011；2山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院；3山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院)

缺血再灌注(IR)后的心肌損傷可引起心肌抑頓、心律失常甚至猝死等事件，嚴(yán)重影響心肌梗死再灌注患者的預(yù)后。因此，如何有效減輕IR造成的心肌損傷有重要研究意義。目前認(rèn)為，心肌IR損傷與能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬及心肌細(xì)胞凋亡等相關(guān)[1]。炎癥反應(yīng)通過中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)釋放，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變血管內(nèi)皮通透性等，促進(jìn)心肌IR損傷的發(fā)展。其中，白細(xì)胞介素6(IL-6)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，人參四物湯緩解心絞痛、心前區(qū)不適、心慌等癥狀起效迅速，明顯改善患者心電圖ST-T改變，提高患者的活動(dòng)耐量[2]。2017年9～11月，我們觀察了人參四物湯預(yù)處理對(duì)大鼠心肌IR損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品、試劑和儀器人參四物湯，主要成分為人參、熟地、當(dāng)歸、川芎、赤芍、煅牡蠣、龍眼肉、三七粉、丹參、麥冬等，由山東山東中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供。血清乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸激酶同工酶(CK-MB)、IL-6檢測試劑盒(Boster公司)；TUNEL試劑盒(Roche公司)；多導(dǎo)生理記錄儀BL-420E(成都泰盟科技有限公司)；HX-200動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；EG1150H全自動(dòng)包埋機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)(Leica公司)；LDZ5-2型離心機(jī)(北京離心機(jī)廠)；Image-Pro Plus 多功能圖像分析管理系統(tǒng)(Media Cybernetics)；BX-5光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量220～250 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(合)20170021。均以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水、飲食。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與用藥處理將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、IR組及人參四物湯低劑量(A)組、高劑量(B)組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。A、B組給予人參四物湯20、80 mg/kg灌胃，Sham組、IR組予以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

1.2.2動(dòng)物模型制備各組末次給藥后，用3.5%水合氯醛(1.0 mL/100 g)腹腔注射；麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣，接心電圖記錄儀，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)。在胸骨左約5 mm處、第3～4肋間剪開皮膚，鈍性分離皮下組織、肌肉；暴露胸腔，剪開心包膜；擠壓胸腔，固定心臟；在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，暴露冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)。用5-0無損傷縫合線于左心耳根部下方1～2 mm處，以深1～2 mm、寬2～3 mm緩慢穿過心肌表層并結(jié)扎。Sham組大鼠只穿線不結(jié)扎。IR組和A、B組均結(jié)扎LAD 30 min，造成心肌缺血后剪斷無損傷縫合線，再灌注120 min以制備大鼠IR模型。結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)：心電圖示標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高或T波高聳，心肌顏色變淺紅色；IR模型成功標(biāo)準(zhǔn)：剪斷無損傷縫合線后記錄的標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段降低≥50%，心肌顏色逐漸轉(zhuǎn)為紅潤。再灌注120 min后取材，測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3血清LDH、CK-MB檢測經(jīng)下腔靜脈緩慢取血10 mL，肝素抗凝；靜置15～20 min后3 000 r/min離心10 min,收集血清。采用ELISA法檢測血清LDH、CK-MB，按照試劑盒說明書操作。

1.2.4心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察經(jīng)頸靜脈注射2 mL伊文思藍(lán)，梗死區(qū)心肌呈現(xiàn)藍(lán)色，非梗死區(qū)未染色。取血結(jié)束后(麻醉狀態(tài))，立即摘取心臟，用生理鹽水沖洗干凈；沿冠狀溝切除右心室，留取左心室。垂直于心臟長軸將心室切成5片，以10%甲醛溶液固定，進(jìn)行心肌石蠟標(biāo)本制備；其余心肌組織用于IL-6水平檢測。每例標(biāo)本取1片心肌組織，常規(guī)石蠟包埋，并切4 μm薄片；HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變。

1.2.5心肌梗死面積測算將大鼠心肌水平切成1～2 mm的薄片，TTC染色。正常心肌可染成紅色，梗死區(qū)未染色。應(yīng)用多功能圖像分析系統(tǒng)計(jì)算左心室面積及梗死區(qū)面積。梗死面積=梗死區(qū)面積/左心室總面積×100%。

1.2.6心肌組織細(xì)胞凋亡檢測采用TUNEL法。以脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)介導(dǎo)的TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞核DNA-OH末端，按試劑盒說明書操作。凋亡細(xì)胞為細(xì)胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒，正常細(xì)胞呈藍(lán)色。采用Olympus BX-5光學(xué)顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍攝，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。AI=視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7心肌組織勻漿液中IL-6檢測剪取左心室心底部部分心肌組織(mg計(jì)量)，以100∶ 1混入生理鹽水(mL計(jì)量)；置于含1 μg/L蛋白酶抑制劑的PBS中勻漿，離心后取上清液于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測IL-6，按照試劑盒說明書操作。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血清LDH、CK-MB水平比較與Sham組比較，IR組大鼠血清LDH及CK-MB水平升高(P均<0.01)；與IR組比較，A組、B組血清LDH及CK-MB水平均下降(P均<0.05)，且B組較A組血清LDH及CK-MB水平降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清LDH、CK-MB水平比較

注：與Sham組比較,aP<0.05，bP<0.01；與IR組比較，cP<0.05；與A組比較，dP<0.05。

2.2各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)比較Sham組大鼠心肌組織僅穿線周圍見少量纖維結(jié)締組織及散在的慢性炎性細(xì)胞浸潤，考慮為穿線所致，其余部位心肌組織未見明顯病理學(xué)改變。IR組大鼠心肌組織間質(zhì)水腫變性明顯，肌纖維紊亂，心肌細(xì)胞胞質(zhì)著色不均勻，可見空泡變性。與IR組比較，A組、B組結(jié)扎周圍心肌細(xì)胞的病變程度明顯減輕。

2.3各組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡情況比較見表2。

表2　　　　各組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡情況比較

注：與Sham組比較,aP<0.05，bP<0.01；與IR組比較，cP<0.05；與A組比較，dP<0.05。

2.4各組大鼠心肌組織勻漿液IL-6水平比較Sham組、IR組、A組、B組大鼠心肌組織勻漿液IL-6分別為(14.07±3.42)、(36.41±3.44)、(26.72±3.33)、(21.70±2.96)ng/mL， IR組>A組>B組>Sham組(P均<0.05)。

3　討論

目前，急性心肌梗死仍是我國發(fā)病率和病死率較高的疾病之一。隨著冠脈介入及搭橋、冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓等再灌注治療的廣泛應(yīng)用，IR損傷成為影響介入療效的重要因素。

炎癥反應(yīng)是IR的重要機(jī)制之一，中性粒細(xì)胞起重要作用。由于炎癥反應(yīng)在心肌缺血階段即被激活，經(jīng)過再灌注，缺血區(qū)血液充盈后，炎癥細(xì)胞進(jìn)入缺血區(qū)，加重IR損傷[3]。同時(shí)，IR激活中性粒細(xì)胞釋放IL-6、IL-1、腫瘤壞死因子α等炎癥介質(zhì)，使中性粒細(xì)胞與冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子結(jié)合，引起血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮功能與結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌損傷，進(jìn)而加重心肌缺血。IL-6是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[4]，正常心肌不表達(dá)或低表達(dá)IL-6，心肌IR可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6[5]。IL-6處于炎癥反應(yīng)調(diào)控的樞紐，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)流入缺血心肌組織，刺激中性粒細(xì)胞、心肌細(xì)胞表面分別表達(dá)CDⅡb及細(xì)胞間黏附分子1，損傷心肌，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。IL-6參與IR過程，其升高在一定程度上反映心肌梗死再灌注的損傷[6]。抑制IR大鼠炎癥因子釋放，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IR組心肌組織梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，同時(shí)伴有心肌組織IL-6水平升高，說明該處組織心肌損傷在持續(xù)發(fā)展。人參四物湯灌胃預(yù)處理大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡和心肌組織中IL-6水平較IR組明顯降低，說明人參四物湯對(duì)IR大鼠心肌損傷有一定抑制作用。

中醫(yī)認(rèn)為，冠心病屬于“胸痹”“真心痛”的范疇，基本病機(jī)為心脈痹阻，“氣虛血瘀”是發(fā)病的主要機(jī)制之一?！靶乇浴睂俦咎摌?biāo)實(shí)之病，本虛則心氣不足、心陽不振、心神失養(yǎng)，標(biāo)實(shí)則氣滯血瘀或痰飲阻滯,故治療應(yīng)當(dāng)標(biāo)本兼顧,以治本為要。人參四物湯以人參、三七、丹參、川芎、熟地、當(dāng)歸、麥冬、龍眼肉、煅牡蠣等組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之效。方中人參大補(bǔ)元?dú)狻⒁鏆怵B(yǎng)心，三七活血化瘀，共為君藥；丹參活血通脈，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，助君藥益氣活血化瘀；麥冬養(yǎng)陰生津，熟地滋陰養(yǎng)血，川芎活血行氣，使諸藥補(bǔ)而不滯,共為臣藥；龍眼肉補(bǔ)益心脾,養(yǎng)血安神，煅牡蠣鎮(zhèn)心安神共為佐使。諸藥合用共作益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，皂苷類化合物是人參、三七中主要的活性成分。人參總皂苷、三七皂苷在心血管疾病的防治方面有明確的藥理效應(yīng)[7]，臨床應(yīng)用廣泛。其在抗心肌缺血，保護(hù)心肌細(xì)胞方面的作用機(jī)制與減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、保護(hù)線粒體功能、抑制炎癥反應(yīng)及抑制凋亡相關(guān)基因的過度表達(dá)等有關(guān)[8～10]。人參皂苷CK通過干預(yù)炎癥細(xì)胞因子高遷移率族蛋白B1的表達(dá)，抑制炎癥的上游細(xì)胞活化，降低血清IL-6水平等，發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[11]。人參皂苷Rb1通過促進(jìn)缺血心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞再生[12]，參與心肌IR損傷的保護(hù)。三七總皂苷可以通過升高細(xì)胞內(nèi)cAMP，抑制炎癥細(xì)胞釋放氧自由基起到抗炎的作用[13]。丹參通過抑制IR大鼠血清IL-6釋放[14]，抑制Nox-2/ROS/JNK2/NF-κB通路，降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。另外，丹參酚酸A明顯抑制心肌缺血時(shí)的炎癥反應(yīng)[15]。

綜上所述，人參四物湯預(yù)處理能縮小心肌IR后心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)心肌IR損傷有明顯抑制作用，其機(jī)制可能與抑制IL-6釋放有關(guān)。