禾葉慈姑的人工繁殖

，　，　　，　，　　

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院全球變化與生物入侵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，　遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，　遼寧 沈陽(yáng) 110866)

禾葉慈姑為澤瀉科慈姑屬的多年生水生草本植物，原產(chǎn)地為北美，在我國(guó)屬于外來(lái)物種[1-2]。該種植物自發(fā)現(xiàn)以來(lái)引起了研究者極大的興趣，主要原因?yàn)槠湓谖覈?guó)表現(xiàn)出較大的特殊性： 1) 研究者僅在遼寧省丹東市發(fā)現(xiàn)了自然生長(zhǎng)的野生群落，屬于遼寧省特有的外來(lái)水生植物[3]； 2) 僅生長(zhǎng)于鴨綠江入?？诘Ｋ焖畢^(qū)域； 3) 隨潮間帶地區(qū)潮水的漲落每晝夜2次完全出水和浸水[4]； 4) 形成明顯的單優(yōu)板塊，基本不與同地區(qū)其他植物混生等。禾葉慈姑在我國(guó)發(fā)現(xiàn)得較晚，又鑒于其諸多特性均適宜作為水生入侵植物研究的優(yōu)良材料，近年來(lái)相關(guān)研究逐漸增多，研究者嘗試從多方面闡明其入侵途徑、種群擴(kuò)散方式及入侵機(jī)理等[5-7]。本研究室著重探討禾葉慈姑入侵對(duì)水環(huán)境中微型生物群落的影響及其與微型生物的互作關(guān)系，研究前期為獲得充足的植物材料，對(duì)禾葉慈姑的越冬方法進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，旨在為該植物的研究提供參考。

禾葉慈姑作為觀賞性植物也極具價(jià)值，我國(guó)的武漢植物園早在多年前就進(jìn)行了人工引種。本研究室還發(fā)現(xiàn)了該種植物在水體凈化方面的特殊作用。對(duì)禾葉慈姑開(kāi)展多方面的研究具有較大的理論和應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1　材　料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

禾葉慈姑(Sagittariagraminea)隸屬于被子植物門(mén)，單子葉植物綱，沼生目，澤瀉科、慈姑屬。供試禾葉慈姑于2016年6月采集自遼寧省丹東市鴨綠江入?？谠铝翇u大橋棧道下(采集地中心經(jīng)緯度[1]：40°5′30″ N，124°21′10″ E)，于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室、日光大棚及室外專(zhuān)用水泥池中進(jìn)行繁殖培養(yǎng)至今。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

KMnO4、HCl、NaOH、KOH、GA、Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液、蒸餾水等。

1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)施、儀器、玻璃器皿及消耗性物品

日光大棚、恒溫培養(yǎng)室、光照培養(yǎng)箱、體式顯微鏡、冰箱、電子天平、微量取樣器、眼科鑷、培養(yǎng)皿、燒杯、濾紙、槍頭等。

1.2　方　法

1.2.1禾葉慈姑種子繁殖方法

1) 禾葉慈姑種子的收集、保存及選種。

當(dāng)年移植回實(shí)驗(yàn)基地的禾葉慈姑花期過(guò)后于秋季進(jìn)入休眠前期，該時(shí)期種子逐漸成熟，顏色逐漸由綠轉(zhuǎn)褐，當(dāng)發(fā)生自然開(kāi)裂時(shí)及時(shí)采收。采收后的保存方法有2種：①放入透氣的布袋或信封中，4 ℃進(jìn)行冷藏保存；②放入盛有清潔蒸餾水的無(wú)蓋容器中，4 ℃進(jìn)行冷藏保存，蒸餾水應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充避免蒸發(fā)干燥。

繁殖前將種子于低溫中取出，逐級(jí)升溫至室溫(20 ℃左右)，置于體式顯微鏡下進(jìn)行選種。選取時(shí)應(yīng)用眼科鑷逐一翻轉(zhuǎn)輕敲，仔細(xì)選取個(gè)大而飽滿的種粒。

2) 禾葉慈姑種子打破休眠的方法。

本試驗(yàn)前期試用了物理法、生物激素法和化學(xué)藥物法。物理法(去除種皮)、生物激素(GA處理)和化學(xué)法中的碳酸鈉、鹽酸和氫氧化鈉處理均未取得較好的結(jié)果(萌發(fā)率≤ 4% )?；瘜W(xué)藥物法中的KOH組結(jié)果較好，采用應(yīng)激處理法，進(jìn)一步設(shè)置了梯度劑量和梯度時(shí)間(表1、表2)，應(yīng)用紙皿法進(jìn)行促進(jìn)萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，每日觀察并記錄種子萌發(fā)情況，7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，21 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)。計(jì)算公式如下[8]：

發(fā)芽率(%)=正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=規(guī)定時(shí)間內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

表1KOH促進(jìn)禾葉慈姑種子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)條件

編號(hào)組別種子數(shù)(個(gè))試劑類(lèi)別濃度(%)處理時(shí)間(h)平行組數(shù)(組)溫度(℃)1對(duì)照組25蒸餾水——3262實(shí)驗(yàn)組25KOH5～301,2,4,6,8326

表2KOH濃度和處理時(shí)間分組及編號(hào)

B:KOH處理時(shí)間(h)A:KOH濃度(%)510152025301A1B1A2B1A3B1A4B1A5B1A6B12A1B2A2B2A3B2A4B2A5B2A6B24A1B3A2B3A3B3A4B3A5B3A6B36A1B4A2B4A3B4A4B4A5B4A6B48A1B5A2B5A3B5A4B5A5B5A6B5

1.2.2禾葉慈姑球莖繁殖的處理方法

禾葉慈姑種子成熟并采收后(沈陽(yáng)市9—10月)由休眠前期進(jìn)入休眠期，該時(shí)期地上部分枯萎，根系形成球莖，于該時(shí)期將植物根部的污泥洗去放入盛有蒸餾水的容器中水培，即可數(shù)出球莖的數(shù)量，確定數(shù)量后將根部重新種植回土中，如在室內(nèi)或大棚中培養(yǎng)需4 d補(bǔ)充一次水分，水面距泥面5 cm；如在室外培養(yǎng)，結(jié)冰之后則不需要補(bǔ)水，第2年春季來(lái)臨冰雪融化時(shí)應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充水分。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置2組實(shí)驗(yàn)(室外和室內(nèi))。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0、Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析單重和多重比較的方法進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　KOH促進(jìn)禾葉慈姑種子萌發(fā)的結(jié)果

應(yīng)用1.2.1方法用不同濃度的KOH溶液處理禾葉慈姑種子，每日觀察記錄萌發(fā)情況，結(jié)果見(jiàn)表3，根據(jù)表3數(shù)據(jù)繪制圖1。表3和圖1的結(jié)果表明：種子萌發(fā)和KOH溶液的濃度和處理時(shí)間相關(guān)性較大，處理時(shí)間較短的3組(AB 1組、AB 2組和AB 3組)的3項(xiàng)指標(biāo)均較低，最高僅達(dá)到10.67%(A 1 B 2組)；處理時(shí)間較長(zhǎng)的AB 4組隨KON濃度升高3項(xiàng)指標(biāo)均升高，最高萌發(fā)率達(dá)到65.33%(A 6 B 4組)，處理時(shí)間最長(zhǎng)的AB 5組3項(xiàng)指標(biāo)普遍較高，最高萌發(fā)率出現(xiàn)于A 4 B 5組(65.33%)。A 5 B 1組、A 6 B 1組和A 6 B 2組種子萌發(fā)被抑制。萌發(fā)率極顯著高于對(duì)照組的共7組(A 5 B 4組、A 6 B 4組、A 2 B 5組、A 3 B 5組、A 4 B 5組、A 5 B 5組和A 6 B 5組)。

組別及編號(hào)禾葉慈姑種子萌發(fā)情況發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽率(%)對(duì)照組11.330.391.33DdA1B12.672.092.67DdA2B11.330.711.33DdA3B11.330.881.33DdA4B11.331.211.33DdA5B10.000.000.00DdA6B10.000.000.00DdA1B210.675.8010.67CDcdA2B24.002.666.67CDdA3B20.000.494.00DdA4B21.331.434.00DdA5B22.672.064.00DdA6B20.000.000.00DdA1B36.673.218.00CDdA2B31.330.721.33DdA3B31.330.922.67DdA4B31.330.881.33DdA5B36.674.216.67CDdA6B32.670.972.67DdA1B41.332.165.33DdA2B42.671.594.00DdA3B44.003.385.33DdA4B46.674.636.67DdA5B417.3310.7820.00CcA6B465.3344.2265.33AaA1B52.672.156.67CDdA2B510.677.9320.00CcA3B540.0029.1256.00ABabA4B554.6742.9665.33AaA5B540.0029.9946.67BbA6B553.3339.7253.33ABb

注：各組數(shù)據(jù)間，有一個(gè)相同字母的即為差異不顯著，沒(méi)有相同標(biāo)記字母的即為差異顯著(小寫(xiě)字母的差異為p<0.05，大寫(xiě)字母的差異為p<0.01)。

圖2　不同條件下禾葉慈姑球莖繁殖的各項(xiàng)指標(biāo)比較

組別及編號(hào)培養(yǎng)條件平行組(組)球莖數(shù)量(個(gè))幼芽萌出率(%)幼芽數(shù)量(個(gè))幼芽成活率(%)子株數(shù)量(個(gè))室外組(SW)室外 54.852.73.091.72.8室內(nèi)組(SN)室溫56.2?94.6??5.8?93.35.4??

注：球莖數(shù)量、幼芽數(shù)量和子株數(shù)量的計(jì)數(shù)方法為1株母株所增殖的數(shù)量。

注：**為與對(duì)照組比較具有極顯著差異(p<0.01)。圖1　KOH處理后禾葉慈姑種子的萌發(fā)率

2.2　室內(nèi)和室外條件下禾葉慈姑越冬球莖及幼芽萌發(fā)及生長(zhǎng)狀況

應(yīng)用1.2.2方法于8月份觀察和記錄室內(nèi)外禾葉慈姑球莖繁殖情況，結(jié)果見(jiàn)表4，根據(jù)表4結(jié)果繪制圖2。結(jié)果表明：球莖及幼芽萌發(fā)的5項(xiàng)指標(biāo)室外組(SW組)均低于室內(nèi)組(SN組)，其中差異不顯著的為幼芽成活率(SW組為91.7%，SN組為93.3%)；存在顯著性差異的指標(biāo)為球莖數(shù)量和幼芽數(shù)量，SW組分別為4.8個(gè)和3.0個(gè)，SN組分別為6.2個(gè)和5.8個(gè)；幼芽萌出率和子株數(shù)量存在極顯著差異。

室溫條件下球莖及幼苗的萌發(fā)均高于室外，球莖數(shù)量SW組為4.8個(gè)，SN組為6.2個(gè)；球莖的幼芽萌發(fā)率2組相差較大，SN組顯著高于SW組(SW組為52.7%，SN組為94.6%)。

3　討論與結(jié)論

種子繁殖和球莖繁殖是禾葉慈姑最主要的2種繁殖及越冬方式，如何在實(shí)驗(yàn)室獲得較高的繁殖效率是進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的首要關(guān)鍵步驟，本研究針對(duì)這2種繁殖方式對(duì)其最適條件進(jìn)行了摸索，得到了較為理想的繁殖條件。在進(jìn)行種子繁殖試驗(yàn)時(shí)，預(yù)先選取了物理法(去除種皮)、生物激素(GA處理)和化學(xué)法中的碳酸鈉[9]、鹽酸和氫氧化鈉等方法[10]，這些方法均獲得了不同程度的發(fā)芽率，但萌發(fā)率較低(最高萌發(fā)率≤10%)，在需要植株較少的實(shí)驗(yàn)中也可以考慮使用。氫氧化鉀處理獲得了較好的萌發(fā)效果，這個(gè)結(jié)果與許多文獻(xiàn)報(bào)道在多種植物萌發(fā)中取得的高萌發(fā)率相一致[11-13]。在氫氧化鉀處理時(shí)，研究者并在處理方法上進(jìn)行了最優(yōu)篩選，從完全浸泡法改為了應(yīng)激處理法，最終獲得了較高的萌發(fā)效率和較好的幼芽成活率(另文報(bào)道)。表3和圖1的結(jié)果表明：氫氧化鉀溶液濃度和處理時(shí)間均與萌發(fā)效率關(guān)系較為密切，其中處理時(shí)間權(quán)重更大，這個(gè)趨勢(shì)從8 h的處理結(jié)果上可以很好的顯示出來(lái)；最適宜的處理時(shí)間區(qū)間應(yīng)為8 h和6 h，其中8 h在設(shè)置的濃度梯度中獲得了峰值(20%，萌發(fā)率65.33%)，6 h處理中濃度與萌發(fā)率呈現(xiàn)線性關(guān)系(30%，65.33%)，但由于氫氧化鉀濃度過(guò)高，后期的幼芽成活率受到了一定的抑制(30%的幼芽成活率小于25%)，因此在應(yīng)用時(shí)不應(yīng)選擇過(guò)高的濃度；多數(shù)處理萌發(fā)效率較低(≤10)，僅有6組與對(duì)照組相比較出現(xiàn)極顯著性差異(p<0.01)，所有的實(shí)驗(yàn)組中缺少具有顯著性差異的處理(p<0.05)，這種極端化的結(jié)果不利于后續(xù)試驗(yàn)及其他研究者選擇萌發(fā)條件。

表4和圖2結(jié)果表明：室內(nèi)(SN組)自然條件下獲得的各項(xiàng)指標(biāo)均高于室外(SW組)，僅幼芽成活率二者之間不存在顯著性差異，其余4項(xiàng)指標(biāo)均存在顯著或極顯著差異，室內(nèi)和室外的光照條件較為相似(室內(nèi)稍弱)，因此造成該種結(jié)果的主要原因是溫差，溫差包括較長(zhǎng)期的季節(jié)溫差(球莖繁殖經(jīng)歷了北方秋、冬和春季)和短期的晝夜溫差，較小的溫差有利于球莖繁殖。

禾葉慈姑室內(nèi)培養(yǎng)的成功從實(shí)驗(yàn)材料的獲得方面具有較大意義，越冬時(shí)未經(jīng)歷室外冬季的冰凍狀態(tài)，很大程度上解決了冬季實(shí)驗(yàn)材料的供給，這也是本研究的主要目的。