北柴胡耐濕害株系HB-1601的生根誘導(dǎo)組織培養(yǎng)條件研究

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(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，　四川 綿陽(yáng) 621010)

柴胡為常用大宗藥材，在我國(guó)臨床應(yīng)用已有2 000余年的歷史?！吨袊?guó)藥典》2010版一部規(guī)定正品柴胡藥材為傘形科植物北柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的干燥根[1]。柴胡作為傳統(tǒng)的中藥材，具有和解表里、疏肝升陽(yáng)、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保肝、止咳等功能。因其需求量的不斷增加，我國(guó)柴胡野生資源日漸減少，導(dǎo)致我國(guó)目前正面臨著柴胡藥用資源短缺的問(wèn)題，因此柴胡的馴化栽培極為重要。為選育高產(chǎn)高效的柴胡品種、探索適宜的栽培方式，得到藥效高、遺傳穩(wěn)定、適合大面積生產(chǎn)，滿(mǎn)足市場(chǎng)需求的柴胡藥材，我國(guó)許多地區(qū)很大程度上發(fā)展柴胡人工種植。本研究中所采用的HB-1601柴胡來(lái)自湖北高雨量地區(qū)，在四川地區(qū)種植時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)良的耐濕、耐草和抗逆性，是一份很好的遺傳資源。但是該株系在四川地區(qū)開(kāi)花結(jié)籽時(shí)恰逢雨季，致使其不能結(jié)實(shí)。為了更好的繁育保存HB-1601，并充分利用其抗逆性遺傳位點(diǎn)，開(kāi)展HB-1601的組織培養(yǎng)工作非常必要。本課題組前期對(duì)北柴胡新品種中柴2號(hào)組織培養(yǎng)工作進(jìn)行了系統(tǒng)研究[2]，但是HB-1601在組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)種質(zhì)差異性，其不能很好的生根，因而針對(duì)此材料進(jìn)行生根研究以保證它的田間繁殖對(duì)北柴胡抗逆性遺傳改良非常重要。

1　材料與方法

1.1　供試材料及保存

供試材料HB-1601系本課題組于湖北神農(nóng)架地區(qū)采集，種植于安縣資源圃原始株，經(jīng)北京藥用植物研究所魏建和研究員鑒定為北柴胡。

參考劉茹等[3]的方法，以其帶側(cè)芽莖段為材料誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)而誘導(dǎo)得到叢生芽，以其無(wú)菌苗為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

1.2　方　法

1.2.1增殖實(shí)驗(yàn)材料

將叢生芽在無(wú)菌環(huán)境中接種到以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IAA，在20 ℃、80%相對(duì)濕度、光照強(qiáng)度1 800 lx、光照12 h，黑暗12 h的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d。得到大量無(wú)菌幼苗。

1.2.2誘導(dǎo)柴胡不定根試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對(duì)NAA(0.1，0.3，0.5 mg/L)、IBA(0.1，0.5，1.0 mg/L)、IAA(0.1，0.5，1.0 mg/L)3種調(diào)節(jié)激素的3個(gè)水平下的柴胡不定根的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行考察，以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，重復(fù)5次，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)(表1)，培養(yǎng)條件同1.2.1?？疾觳欢ǜ纳L(zhǎng)個(gè)數(shù)，篩選對(duì)誘導(dǎo)柴胡不定根有正向效應(yīng)的激素濃度。

1.2.3柴胡指標(biāo)的測(cè)定

將培養(yǎng)的柴胡無(wú)菌苗移栽到誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)基中30 d后，得到很多不定根系，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對(duì)組織生根影響顯著，考察不定根個(gè)數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素、鮮重及干重。

表1誘導(dǎo)柴胡HB-1601不定根單因素(mg/L)

因素(mg/L)水平12345678910NAAck0.10.30.5IBAck0.10.51.0IAAck0.10.51.0

2　結(jié)果與分析

試驗(yàn)采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。方差分析結(jié)果表明，不同的培養(yǎng)基對(duì)柴胡的主根數(shù)、鮮重、葉綠素均有顯著影響，對(duì)柴胡的平均根長(zhǎng)有極顯著影響，而對(duì)柴胡的干重影響不顯著(表2)。重復(fù)對(duì)不定根數(shù)、根長(zhǎng)、鮮重、葉綠素及干重等5個(gè)指標(biāo)影響都不顯著(p>0.05)。

表2不同生長(zhǎng)激素對(duì)柴胡HB-1601各測(cè)定指標(biāo)的方差分析

性狀SSdfMSFSig組間方差239.657926.6292.8250.013不定根數(shù)組內(nèi)方差339.3369.45總和578.95745組間方差26.48692.9433.5540.003根長(zhǎng)組內(nèi)方差29.808360.828總和56.29445組間方差3534748.3179392749.8132.160.049鮮重組內(nèi)方差6546051.1136181834.753總和1.01E+0.745組間方差774.629986.072.1640.049葉綠素組內(nèi)方差1431.9963639.778總和2206.62545組間方差52151.85295794.650.9260.515干重組內(nèi)方差225355.04366259.862總和277506.89245

對(duì)NAA、IBA、IAA 3種調(diào)節(jié)激素的3個(gè)水平下柴胡的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析(表3，圖1)，各調(diào)節(jié)激素對(duì)北柴胡生長(zhǎng)影響如下：

NAA、IBA、IAA 3種調(diào)節(jié)激素對(duì)誘導(dǎo)北柴胡不定根均有正向效應(yīng)。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果顯著高于另外2種濃度；當(dāng)調(diào)節(jié)激素為IBA時(shí)，0.5 mg/L和1.0 mg/L 2種濃度的誘導(dǎo)效果相同，誘導(dǎo)效果顯著；當(dāng)IAA濃度為0.1 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果顯著高于另外2種濃度。綜合比較各激素對(duì)不定根數(shù)的誘導(dǎo)效果認(rèn)為，IBA的誘導(dǎo)效果最佳，其中0.5 mg/L和1.0 mg/L的IBA激素對(duì)誘導(dǎo)不定根數(shù)效果為極顯著。

NAA、IBA、IAA 3種調(diào)節(jié)激素對(duì)北柴胡根長(zhǎng)生長(zhǎng)均有影響。NAA調(diào)節(jié)激素對(duì)柴胡根長(zhǎng)生長(zhǎng)有負(fù)效應(yīng)，其中0.5 mg/L濃度的NAA抑制作用最為明顯，可見(jiàn)NAA激素不利于柴胡根的生長(zhǎng)；IBA、IAA 2種調(diào)節(jié)激素3種不同的濃度水平下對(duì)對(duì)柴胡根長(zhǎng)生長(zhǎng)均有正向效應(yīng)，其中濃度為0.5 mg/L的IBA誘導(dǎo)效果為顯著。綜合比較各激素對(duì)根長(zhǎng)影響效果認(rèn)為，0.5 mg/L的IBA促進(jìn)根長(zhǎng)生長(zhǎng)效果最佳。

表3不同生長(zhǎng)激素中柴胡HB-1601的生長(zhǎng)差異

培養(yǎng)基不定根數(shù)根長(zhǎng)(cm)鮮重(g)葉綠素干重(g)12.75a2.45abc871.33a42.28ab207.13ns27.6bc2.16ab1307.1abc54.32c259.34ns37.2abc1.46a1195.86abc50.7bc230.48ns45ab1.24a942.08ab43.94ab197.78ns55.75abc3.01bc963.23ab45.7abc185.53ns610c3.63c1586.33bc44.85abc269.13ns710c2.99bc1646.5c46.1abc257.32ns88bc3.21bc1026.1abc40.4a190.5ns95.5abc2.85bc1118.03abc47.85abc184.65ns103.8ab3.22bc786.5a42.38ab173.54ns

注：顯著性(p<0.05)。

表4不同激素濃度對(duì)柴胡HB-1601測(cè)定指標(biāo)的影響

激素及濃度(mg/L)不定根數(shù)增長(zhǎng)率(%)根長(zhǎng)增長(zhǎng)率(%)鮮重增長(zhǎng)率(%)葉綠素增長(zhǎng)率(%)干重增長(zhǎng)率(%)NAA0.1176-11.805028.50?25NAA0.3161.81-40.5737.2519.9311.28NAA0.580.81-49.388.122.46-4.51IBA0.1109.0922.4510.548.11-10.43IBA0.5263.64?48.58?82.065.4529.93IBA1.0263.6?22.0488.97?9.1724.2IAA0.1190.0931.0017.76-4.44-8.03IAA0.510016.3328.3113.19-10.85IAA1.038.1831.43-9.740.2516.21

注：“*”表示p<0.05。

注：a為ck，b為0.1 mg/L NAA，c為0.3 mg/L NAA，d為0.5 mg/L NAA，e為0.1 mg/L IBA，f為0.5 mg/L IBA，g為1.0 mg/L IBA，h為0.1 mg/L IAA，i為0.5 mg/L IAA，j為1.0 mg/L IAA。圖1　不同生長(zhǎng)激素對(duì)柴胡HB-1601根生長(zhǎng)的影響

NAA、IBA、IAA 3種調(diào)節(jié)激素對(duì)北柴胡鮮重均有影響：NAA、IBA 2種激素3種不同的濃度水平下對(duì)柴胡的鮮重均有正向效應(yīng)，其中1.0 mg/L的IBA對(duì)北柴胡鮮重的影響為極顯著；當(dāng)調(diào)節(jié)激素為IAA時(shí)，0.1 mg/L和0.5 mg/L的濃度對(duì)柴胡鮮重有正向效應(yīng)，1.0 mg/L的濃度有抑制作用。綜合比較各激素對(duì)柴胡鮮重的影響效果認(rèn)為，濃度為1.0 mg/L的IBA效果最佳，有極顯著影響。

NAA、IBA、IAA 3種調(diào)節(jié)激素對(duì)北柴胡鮮重均有影響：NAA、IBA 2種調(diào)節(jié)激素3種不同水平對(duì)誘導(dǎo)柴胡葉綠素含量均有正向效應(yīng)，其中NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)效果顯著。當(dāng)調(diào)節(jié)激素為IAA，濃度為0.1 mg/L時(shí)對(duì)誘導(dǎo)葉綠素含量表現(xiàn)為抑制作用，濃度為0.5 mg/L時(shí)有明顯的正向效應(yīng)，濃度為1.0 mg/L時(shí)無(wú)明顯效果。綜合比較，各激素對(duì)誘導(dǎo)柴胡葉綠素含量的影響效果認(rèn)為，濃度為0.1 mg/L的NAA有顯著影響，效果最佳。

分析結(jié)果表明，各激素對(duì)柴胡的干重影響不顯著，這可能是取樣量太少導(dǎo)致的結(jié)果。

3　結(jié)論與討論

四川省青川縣馬公及周邊地區(qū)野生柴胡資源豐富，分布較廣，已有300多年種植歷史，是柴胡的著名道地產(chǎn)區(qū)。目前我國(guó)選育的北柴胡新種包括中柴1號(hào)、中柴2號(hào)、中柴3號(hào)和川北柴1號(hào)4個(gè)品種[4]。其中中柴1～3號(hào)品種廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西北、華東等地[5]。川北柴1號(hào)系四川首個(gè)北柴胡審定新品種，該品種在多年多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn)中較四川地方栽培種及中國(guó)主要柴胡品種中柴1號(hào)表現(xiàn)出顯著產(chǎn)量及藥效品質(zhì)。但川北柴1號(hào)是中柴2號(hào)在四川多年多點(diǎn)引種試驗(yàn)中逐步馴化育成，其田間耐濕、耐草性較差。北柴胡品系HB-1601是本課題組在湖北高雨量地區(qū)的一種特異性資源，在安縣資源圃實(shí)驗(yàn)地種植多年，表現(xiàn)為較高的耐草性和耐澇性，是一份很好的遺傳資源，適宜于對(duì)川北柴1號(hào)的耐濕抗草性改良。但HB-1601在四川地區(qū)開(kāi)花授粉時(shí)恰逢雨季，致使其不能結(jié)實(shí)，因此為開(kāi)展HB-1601的組織培養(yǎng)工作對(duì)突破性柴胡新品種選育極為重要。

目前柴胡屬植物組織培養(yǎng)工作報(bào)道較多。姚智等對(duì)北柴胡愈傷組織和誘導(dǎo)不定根進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，柴胡的愈傷組織適宜于在MS+NAA 4 mg/L+KT 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，或MS+NAA 2 mg/L+KT 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，而誘導(dǎo)不定根宜采用MS+IBA 2 mg/L+KT 0.2 mg/L，MS+IBA 1 mg/L+KT 0.2 mg/L或MS+IAA 8 mg/L+KT 0.2 mg/L的培養(yǎng)基[7]。楊東方等研究了柴胡外植體采樣時(shí)期、大小和種類(lèi)等因素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響，結(jié)果表明，4月上旬所采集的北柴胡的根是誘導(dǎo)愈傷組織最適宜的材料，長(zhǎng)1.0 cm左右的根切段有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，在添加IBA 0.5 mg/L的1/2 MS培養(yǎng)基中，帶側(cè)芽莖段不定根的誘導(dǎo)率可達(dá)97.3%[6]。郝建平等研究了北柴胡愈傷組織葉片、莖段及花芽愈傷組織的誘導(dǎo)、分化和不定芽增殖的條件，并得出NAA 0.5 mg/L的1/2 MS培養(yǎng)基是生根的適宜培養(yǎng)基的結(jié)論[8]。綜合本研究中各激素對(duì)上述測(cè)定指標(biāo)的影響效果，認(rèn)為濃度為0.5 mg/L的IBA是誘導(dǎo)柴胡生根的最佳組培條件。楊東方等[6]在北柴胡不定根培養(yǎng)中也得出來(lái)同樣結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，北柴胡HB-1601與其他北柴胡間存在種質(zhì)差異，其中芽誘導(dǎo)的組培條件基本一致，而生根培養(yǎng)存在差異性。因此，總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)針對(duì)本研究中HB-1601做了一個(gè)特異性的生根誘導(dǎo)方案，旨在為保存此特異性種子遺傳資源提供科學(xué)依據(jù)，供遺傳改良用，并非為了滿(mǎn)足生產(chǎn)要求。