兔肝腫瘤射頻消融術(shù)后循環(huán)血中T細(xì)胞、NK細(xì)胞的表達(dá)

楊闖 張永川 古廣強(qiáng) 何靜宇

（綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院 四川 綿陽(yáng) 621000）

引言

射頻消融是近年來(lái)被廣泛用于實(shí)體瘤治療的一種新型微創(chuàng)技術(shù)，其在應(yīng)用時(shí)采用超聲引導(dǎo)，經(jīng)電極針向腫瘤中心做定點(diǎn)發(fā)射，使肌瘤處于帶電狀態(tài)，在高頻交流電的作用下，促使實(shí)體瘤內(nèi)的離子發(fā)射高頻振動(dòng)，產(chǎn)生熱量，從而達(dá)到使腫瘤細(xì)胞脫水、凝固、壞死的目的[1]。雖然目前臨床中對(duì)于射頻消融技術(shù)治療效果方面的研究較多，但是關(guān)于其對(duì)機(jī)體免疫功能的影響報(bào)道較少。本次研究將通過(guò)建立兔肝臟原位種植XV2腫瘤模型，行射頻消融治療（RFA）后，探討射頻消融術(shù)對(duì)荷瘤兔機(jī)體免疫反應(yīng)的影響情況。

1.資料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

研究選取純種的3～4月齡新西蘭大耳兔共28只，體重在2.5～3.5kg之間，雌雄比例不限。所有種兔均為已建立好的長(zhǎng)有VX2腫瘤的研究用兔。根據(jù)是否進(jìn)行射頻消融治療，將28只分為對(duì)照組（10只）和射頻消融組（18只），兩組兔子的基本情況和發(fā)病情況相似，P＞0.05，具有可對(duì)比性。

1.2 主要試劑及儀器

射頻治療采用美國(guó)Radio Therapeutics公司生產(chǎn)的RF 2000TM射頻治療系統(tǒng)，射頻消融針采用該設(shè)備配套射頻消融針，應(yīng)用美國(guó)BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)的Epics XL型流式細(xì)胞儀。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體試劑盒由邁新生物技術(shù)有限公司提供，Bcl-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒由北京瑞格博科技有限公司提供。

1.3 標(biāo)本采集及處理

所有對(duì)照組荷瘤兔不進(jìn)行治療，射頻消融組荷瘤兔在超聲引導(dǎo)下行射頻消融進(jìn)行治療，在射頻消融后1周、2周、4周時(shí)，采集兩組荷瘤兔兔耳部（中央）動(dòng)脈血10ml，置入肝素抗凝無(wú)菌試管內(nèi)，離心備用。將射頻消融組荷瘤兔分別分為三組，分別在術(shù)后1周、2周和4周時(shí)處死，選取行射頻消融治療后的凝固行壞死組織及其便于1cm組織作為標(biāo)本，待用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將采集到的外周血標(biāo)本應(yīng)用Epics XL型流式細(xì)胞儀，對(duì)兩組荷瘤兔的T細(xì)胞濃度、T細(xì)胞活性以及NK細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用免疫組化法，應(yīng)用相應(yīng)的試劑盒，對(duì)兩組荷瘤兔Bcl-2和VEGF水平進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以率（%）表示，兩組比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 T細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)

在治療前，兩組荷瘤兔的T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞表達(dá)水平基本接近，P＞0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在治療后，兩組荷瘤兔的各項(xiàng)指標(biāo)水平具有著明顯的差異性，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 兩組荷瘤兔治療前后T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞水平對(duì)比

2.2 VECF和Bcl-2的表達(dá)

射頻中心損毀區(qū)域內(nèi)無(wú)VECF表達(dá)，但在殘余腫瘤區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)VECF表達(dá)，射頻組荷瘤兔的VECF表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。而對(duì)照組荷瘤兔的Bcl-2也明顯高于射頻消融組，P＜0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)段兩組荷瘤兔VECF表達(dá)水平分析

圖1 Bcl-2免疫組化

3.討論

VX2腫瘤是一種由Shope病毒所誘導(dǎo)的兔乳頭狀瘤所衍生出的一種鱗癌[2]。本次研究以腫塊預(yù)埋發(fā)制備出所需的兔肝腫瘤模型，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)。射頻消融術(shù)是近年來(lái)被用于實(shí)體瘤治療的一種新型微創(chuàng)治療技術(shù)[3]，利用離子之間相互碰撞產(chǎn)生熱量的原理，提高局部溫度，從而達(dá)到使腫瘤細(xì)胞脫水、凝固、壞死的目的[4]。由于射頻消融在用于腫瘤治療是主要是依靠高溫原理來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞，使得病灶組織凝固、壞死，故而其效果類似與手術(shù)切除。由于熱效應(yīng)對(duì)于機(jī)體的免疫力有著良好的促進(jìn)效果，故而行射頻消融治療能否對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生影響，成為近年來(lái)臨床中研究的一個(gè)熱門問(wèn)題。

T臨床亞群細(xì)胞的平衡情況是維持機(jī)體內(nèi)部免疫系統(tǒng)環(huán)境平衡的重要因素，而CD4+/CD8+比值則為機(jī)體內(nèi)部免疫狀態(tài)是否動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的重要表達(dá)指標(biāo)，如比值過(guò)低，則提示機(jī)體的免疫能力下降。本次研究結(jié)果顯示，在未進(jìn)行治療前，對(duì)照組與觀察組各項(xiàng)指標(biāo)水平是基本接近的（P＞0.05），但在經(jīng)射頻消融治療后兩周左右時(shí)，兩組荷瘤兔的指標(biāo)水平明顯改善（P＜0.05），但是RFA治療組的荷瘤兔機(jī)體免疫細(xì)胞活性呈現(xiàn)小幅上升趨勢(shì)，而到治療4周左右時(shí)，射頻消融組荷瘤兔的免疫細(xì)胞活性水平與對(duì)照組呈現(xiàn)出明顯的差異性，這可能與熱效應(yīng)能夠增加荷瘤兔機(jī)體免疫能力，經(jīng)過(guò)射頻消融治療后，凝固壞死的腫瘤組織仍然殘留在機(jī)體內(nèi)，激活免疫系統(tǒng)以及機(jī)體本身腫瘤負(fù)荷減少有關(guān)。故而我們認(rèn)為，射頻消融術(shù)能夠通過(guò)對(duì)腫瘤微血管的破壞作用，控制腫瘤血管的形成，同時(shí)還能夠提高機(jī)體的免疫能力。

4.結(jié)論

射頻消融技術(shù)作為一種新型實(shí)體瘤治療方案，其在用于肝臟腫瘤治療時(shí)，能夠顯著提高機(jī)體的細(xì)胞免疫能力，對(duì)于延長(zhǎng)生存期有著重要的意義，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]朱迎,欽倫秀.肝癌免疫生物治療的現(xiàn)狀及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)實(shí)用外科雜志,2016,14(6)：636-41.

[2]張洪新,劉燕,曹偉,等.兔肝VX2移植癌改良模型的建立[J].腫瘤防治研究雜志,2002,29：1-3.

[3]VARNEY M L，SINGH RK．VEGF-C-VEGF R 3/Flt4 axis regu lates mammary tumor growth and metastasis in an autocrine manner[J].Am J Cancer R es,2015,5(2)：616-628.

[4]Ronnie TP.Prevention of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma：A daunting challenge[J].Hepatology,2011,54(3)：757-759．