HPLC-MS/MS法測定濟(jì)寧市區(qū)河水中4種喹諾酮類抗生素殘留

張 凱 公維磊 倪永付 劉杰鋒 慕明偉

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，濟(jì)寧 272067；2濟(jì)寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,濟(jì)寧 272000；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院,濟(jì)寧 272067)

抗生素(SAs)是最常見的抗菌藥物之一，由于使用頻繁，許多水體中都有可能產(chǎn)生殘留，我國許多地區(qū)的水環(huán)境中都被檢出過[1-2]。水體中抗生素殘留濃度通常在μg/L或ng/L的水平[3-4]。雖然大多數(shù)抗生素的半衰期短，但由于使用頻繁并易進(jìn)入水體環(huán)境，導(dǎo)致形成“假持續(xù)”現(xiàn)象，進(jìn)而對(duì)人類及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成產(chǎn)生長期的潛在危害。其中喹諾酮藥物因其具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小及價(jià)格低廉等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類的多種感染性疾病的預(yù)防和治療[5]。濟(jì)寧市區(qū)河流較多，許多支流途徑市區(qū)、多家醫(yī)院、養(yǎng)殖場等，為了解目前濟(jì)寧市區(qū)河水中喹諾酮類抗生素的現(xiàn)狀，評(píng)價(jià)其河水治理的水平。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法對(duì)司帕沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸4種常用喹諾酮諾抗生素殘留進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料

4種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品：司帕沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸，以上4種標(biāo)準(zhǔn)品均來自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度在98%以上；甲醇、乙酸乙酯、甲酸、鹽酸、乙腈均為色譜純,均由天津永大化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器

超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters Acquity UPLC/Xevo TQMS型，購于美國Waters公司；雷磁PHSJ-3F,上海精科；真空泵AP-01P,天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HLB固相萃取柱6cc/500mg，WAT106122 Cartridge，Rev,A；0.22μm濾膜，南通市衛(wèi)寧實(shí)驗(yàn)器材有限公司；HN200多功能氮吹儀,上海海能科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣品采集 在濟(jì)寧市區(qū)大運(yùn)河、老運(yùn)河人口稠密區(qū)和藥品生產(chǎn)廠家附近河段采集20個(gè)水樣各0.5L和供加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的4個(gè)水樣各2L，置于棕色玻璃瓶中，并加入500mg/L的疊氮化鈉抑制微生物的生長，采集完成后放置4℃保存，48h之內(nèi)富集完成。

1.3.2樣品處理 HLB固相萃取柱在使用之前需進(jìn)行潤洗：1)先用6ml乙酸乙酯：甲醇(1∶1)溶液潤洗脫，2)再用6ml甲醇潤洗，3)最后用6ml酸性水(pH4.2)潤洗。水樣在富集前先用定性濾紙過濾，然后再用0.22μm的濾膜過濾；濾液過柱富集完成之后，抽真空干燥5～8min，之后用6ml 0.5%甲醇淋洗，再用6ml甲醇洗脫至10ml棕色玻璃比色管中，最后吹氮?dú)鉂饪s0.1ml以下。4)轉(zhuǎn)移至0.5ml的樣品瓶中，再用0.1%的甲酸定容至0.5ml上機(jī)檢測。

1.3.3加標(biāo)回收樣品的處理 水樣在富集前先用定性濾紙過濾，然后再用0.22μm的濾膜過濾，再將水樣分成4份，各500ml。其中一份與前面水樣一起直接過柱富集，另外3份按照低、中、高3種濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，同上過柱富集,水樣流速控制在5ml/min以下。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將司帕沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸配制成濃度為1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇-水(體積為2∶1)定容，-20℃避光保存。然后用上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐步稀釋配置成濃度為5、10、20、50、100、200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件與優(yōu)化

2.1.1色譜條件 Hypersil GOLD-1.9μm，50mm×2.1mm(i.d)色譜柱；柱溫30℃；進(jìn)樣量為5μl；流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈，流速250μl/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.1.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源；電離模式為正離子；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓4500V；鞘氣壓力2．07×105Pa；清掃氣壓力0；輔助氣壓力6.89×104Pa；離子源溫度350℃。

2.1.3流動(dòng)相的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相有乙腈-水、甲醇-乙腈-水、乙酸銨-乙腈等[5-6]。綜合相關(guān)文獻(xiàn)后我們發(fā)現(xiàn)低濃度的甲酸-乙腈作為流動(dòng)相，可以加強(qiáng)離子化效率，提高方法靈敏度。在綜合比較了0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的甲酸-乙腈作為流動(dòng)相的響應(yīng)值和峰形效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)所測的4種喹諾酮類抗生素，分離度高，響應(yīng)效果好。見圖1。

注：洛美沙星，4.04min;司帕沙星，4.14min; 氟甲喹，4.45min;萘啶酸，4.65min

圖1 0.1%的甲酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)4種喹諾酮類抗生素色譜圖

2.1.4洗脫劑的選擇 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其他條件相同情況下甲醇對(duì)司帕沙星、氟甲喹等4種喹諾酮類抗生素的回收率相對(duì)較好，所以選擇甲醇作為洗脫劑。見表3。

表2 3種洗脫劑的回收率

2.1.5萃取速度的選擇 萃取速度是影響富集效率的重要一環(huán)，太快可能會(huì)導(dǎo)致富集效率下降，太慢則會(huì)導(dǎo)致富集時(shí)間過長。在此過程中可能會(huì)受到較多外部因素的干擾，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萃取速度在2～5ml/min時(shí)回收率高、重現(xiàn)性好。

2.1.6方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限、定量限、精密度(RSD)、回收率 配制濃度為5、10、20、50、100、200μg/L的4種喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在5～200μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9921～0.9987，以3倍信噪比確定檢出限，均為3μg/L，以10倍信噪比確定定量限，均為10μg/L。另取供加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)水樣2L，平均分成4份，每份500ml,其中1份作空白，其他3份分別加入4種喹諾酮類抗生素，分別配制成20、100、200μg/L的低、中、高3種濃度的溶液，按照上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和精密度，4種喹諾酮類濃度為20μg/L時(shí)，回收率86.0%～103.6%；濃度為100μg/L時(shí)，回收率85.6%～107.4%；濃度為200μg/L時(shí)，回收率81.9%～115.0%，其RSD均<10%。見表3。

表3 4種喹諾酮類抗生素的定量限、相關(guān)系數(shù)、線性方程及回收率

2.2 水樣測定結(jié)果

20份水樣中均未檢出司帕沙星、洛美沙星、萘啶酸，只有氟甲喹出現(xiàn)了峰，濃度在3.10～6.64×105，但濃度較低，低于檢測限。

3 討論

HPLC-MS/MS法靈敏度高、檢出限低、適用范圍廣、準(zhǔn)確性好。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)水樣進(jìn)行了富集濃縮，然后上機(jī)檢測，相比傳統(tǒng)方法在較大程度上提高了該方法的靈敏度。另外對(duì)色譜條件、洗脫劑、流動(dòng)相以及萃取速度等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)該方法進(jìn)行了質(zhì)量控制，保障結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度，能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)水體中司帕沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸4種喹諾酮類抗生素進(jìn)行檢測。

所檢測的20個(gè)水樣中在檢出限為3μg/L內(nèi)均未檢出司帕沙星、洛美沙星、萘啶酸，但均檢出了氟甲喹，其含量均低于定量限10μg/L。這可能與濟(jì)寧市近些年對(duì)運(yùn)河附近的相關(guān)污染企業(yè)、工廠進(jìn)行了整改以及加強(qiáng)了污水排放處理，大運(yùn)河水質(zhì)優(yōu)良，污染可以忽略不計(jì)。另外，喹諾酮類抗生素在水中的溶解性較差，易受水環(huán)境的溫度、某些離子濃度和光照等影響，水樣在過濾、富集時(shí)也可能會(huì)有附著在懸浮顆粒物上的樣品損失。有文獻(xiàn)報(bào)道一些喹諾酮藥物在水體的半衰期不超過半年[7]，雨水也有一定的稀釋作用，因此，本地區(qū)司帕沙星、洛美沙星、萘啶酸含量極低。所有水樣均檢出了氟甲喹，雖然濃度較低，不超過國家標(biāo)準(zhǔn)，但說明濟(jì)寧市大運(yùn)河市區(qū)段已受到了氟甲喹的污染，而氟甲喹是一種高效的廣譜抗菌藥，主要用于畜禽疾病的治療，該污染來源有可能是周邊畜禽市場、畜禽養(yǎng)殖場排放污水所致。因此,希望有關(guān)部門及早加強(qiáng)其檢測和監(jiān)督。

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