大黃結(jié)合蒽醌提取條件的優(yōu)化

李 景，劉喜綱，劉翠哲

(承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000)

大黃為一種常用中藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、逐瘀通經(jīng)等功效，其生品臨床上多用于治療便秘。大黃中主要含蒽醌類(lèi)化合物，分為結(jié)合蒽醌和游離蒽醌，其中結(jié)合蒽醌是大黃的主要致瀉成分，由于結(jié)合蒽醌不能被上消化道的α-糖苷鍵酶水解，因糖的保護(hù)，也不易被上消化道吸收，當(dāng)其進(jìn)入大腸后被腸內(nèi)β-糖苷鍵酶水解，釋放出游離蒽醌，游離蒽醌刺激腸壁，進(jìn)而產(chǎn)生瀉下作用。另外，一小部分結(jié)合蒽醌經(jīng)小腸吸收，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為游離蒽醌轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸，刺激神經(jīng)叢增加蠕動(dòng)而致瀉。大黃中的游離蒽醌絕大多數(shù)在上消化道被吸收或破壞，不能到達(dá)大腸。傳統(tǒng)大黃煎劑常采用“生品后下”的方法[1，2]，就是為保證結(jié)合蒽醌的含量來(lái)發(fā)揮瀉下藥效。而2015版《中國(guó)藥典》中，要求大黃中總蒽醌含量不少于1.5%，游離蒽醌不少于0.20%，尚未對(duì)起瀉下作用的結(jié)合蒽醌制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使得現(xiàn)今的大黃提取工藝研究主要以總蒽醌為指標(biāo)[3，4]，結(jié)合蒽醌并未得到應(yīng)有的重視，且近來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物較多地報(bào)道了大黃蒽醌類(lèi)化合物的腎毒性和致癌性[5，6]，可能為蒽醌類(lèi)成分吸收入血，在體內(nèi)引起代謝異常，產(chǎn)生潛在毒性。對(duì)此，本試驗(yàn)以結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率和游離型與結(jié)合型蒽醌比例為指標(biāo)，提高結(jié)合蒽醌含量，同時(shí)控制游離蒽醌的含量，保證瀉下藥效，降低游離蒽醌在體內(nèi)吸收入血可能引起的毒性，篩選出大黃結(jié)合蒽醌的最佳提取條件，為大黃制劑的發(fā)展提供理論支持。

1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，F(xiàn)W80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，GT16-3型離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)，AG254型分析天平(梅特勒-托利多)，KQ-300型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HSC-12A型氮?dú)獯蹈蓛x(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào)110795-201007，純度：98.0%)、大黃酸對(duì)照品(批號(hào)110757-200206，純度：99.4%)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)110756-201512，純度：98.7%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)110796-201319，純度：99.6%)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)110758-201616，純度：99.0%)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。大黃藥材購(gòu)自安國(guó)市邦康中藥材有限公司，由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所研究員趙春穎鑒定為蓼科植物藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根及根莖，甲醇(色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)，95%乙醇、三氯甲烷均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定方法

2.1.1色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(70∶30)，柱溫：30 ℃，流速：0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1供試品溶液的制備 按照2015版《中國(guó)藥典》中大黃蒽醌供試品溶液的制備方法[7]，將大黃藥液過(guò)濾，取適量續(xù)濾液15 000 r/min離心10 min，進(jìn)樣測(cè)定游離蒽醌含量；精密量取續(xù)濾液1 ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，離心進(jìn)樣，測(cè)定總蒽醌含量。結(jié)合蒽醌含量=總蒽醌含量-游離蒽醌含量；結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率=藥液中結(jié)合蒽醌含量/藥材中結(jié)合蒽醌含量。

2.1.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆薈大黃素4.51 mg、大黃酸4.42 mg、大黃素4.33 mg、大黃酚1.58 mg和大黃素甲醚2.16 mg，分別置于10 ml量瓶中，加入適量甲醇，超聲使溶解，加甲醇定容至刻度，得5種大黃蒽醌類(lèi)成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取大黃素甲醚對(duì)照品溶液5 ml，其余4種對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 ml，置于50 ml量瓶中，加入適量甲醇，超聲混勻，加甲醇定容至刻度，得上述5種大黃蒽醌類(lèi)成分質(zhì)量濃度分別為90.20、88.40、31.60、85.60和21.60 mg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取上述混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、8、10、15和20 μl，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，回歸方程及線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

2.1.4精密度考查 將混合對(duì)照品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.6%、0.6%、0.3%、0.8%和0.3%，表明儀器精密度良好。

表1 5種大黃蒽醌類(lèi)成分的回歸方程及線(xiàn)性范圍

2.1.5穩(wěn)定性考查 將大黃藥液放置0、4、8、12、16、20和24 h后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為2.0%、2.7%、0.4%、0.5%和2.4%，表明大黃藥液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6重復(fù)性考查 精密量取大黃藥液適量，按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法各制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果大黃游離蒽醌供試品溶液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的質(zhì)量濃度平均值分別為113.12、128.34、38.17、3.61和2.98 μg/ml，RSD依次為0.7%、1.0%、0.8%、0.7%和0.5%；這5個(gè)成分在大黃總蒽醌供試品溶液中的質(zhì)量濃度分別為591.54、305.94、160.22、117.69和51.52 μg/ml，RSD依次為0.5%、1.3%、1.1%、0.9%和0.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.7加樣回收率考查 取大黃藥液適量，分別精密加入一定量的5種大黃蒽醌類(lèi)成分混合對(duì)照品溶液，按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制備總蒽醌供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及其RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均回收率分別為99.52%、99.20%、98.67%、99.97%和98.99%，RSD分別為0.6%、0.7%、1.5%、1.1%和2.1%，見(jiàn)表2-表6。

表2 蘆薈大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2大黃藥材中蒽醌的含量測(cè)定 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.15 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量[7]，按照“2.1”項(xiàng)下含量測(cè)定方法，測(cè)得游離蒽醌和總蒽醌含量百分?jǐn)?shù)分別為0.22%和2.06%，符合大黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 大黃酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 大黃酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 大黃素甲醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3影響大黃結(jié)合蒽醌提取的因素考查 試驗(yàn)選擇結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率和游離型與結(jié)合型蒽醌比例作為指標(biāo)，主要對(duì)乙醇濃度，溶劑體積，是否浸泡及提取時(shí)間幾個(gè)因素進(jìn)行考查，篩選出最佳的提取條件。

2.3.1不同乙醇濃度對(duì)大黃結(jié)合蒽醌提取的影響 取大黃飲片3份，每份10 g，分別加入10倍量的水、30%乙醇和50%乙醇，加熱回流，提取3次，每次0.5 h，過(guò)濾，合并3次濾液，按照“2.1”項(xiàng)下含量測(cè)定方法制備供試品溶液并檢測(cè)各蒽醌含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 乙醇濃度對(duì)結(jié)合蒽醌成分提取的影響

結(jié)果表明，選用50%乙醇提取得到的結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率最高，水提取的與之相差不大，水提取的游離與結(jié)合蒽醌比例最理想，同時(shí)考慮到后期乙醇回收也會(huì)降低結(jié)合蒽醌含量，以及成本等問(wèn)題，故選擇水作為提取溶劑。

2.3.2不同溶劑體積對(duì)大黃結(jié)合蒽醌提取的影響 取大黃飲片4份，每份10 g，分別加入5、10、15和20倍量的水，加熱回流，提取3次，每次0.5 h，過(guò)濾，合并3次濾液，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定各蒽醌含量。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 溶劑體積對(duì)結(jié)合蒽醌成分提取的影響

結(jié)果表明，10倍量提取的藥液結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率與游離結(jié)合蒽醌比例均為最優(yōu)，故選擇10倍量水提取。

2.3.3是否浸泡及提取時(shí)間對(duì)大黃結(jié)合蒽醌提取的影響 取大黃飲片4份，每份10 g，分別加入10倍量的水，兩份浸泡過(guò)夜，另外兩份不浸泡，按表9中條件加熱回流，提取3次，過(guò)濾，合并3次濾液，按照“2.1”項(xiàng)測(cè)定方法制得供試品溶液并檢測(cè)各蒽醌含量。浸泡過(guò)夜提取的藥液中游離蒽醌含量明顯升高，結(jié)合蒽醌含量明顯降低，故選用不浸泡提取。不浸泡條件下，每次煎煮30 min的結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率與游離結(jié)合蒽醌比例均明顯優(yōu)于每次煎煮20 min，故選用不浸泡，每次提取30 min。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定工藝為：大黃飲片加入10倍量的水，加熱回流提取3次，每次0.5 h。大黃藥液中結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率可達(dá)37%，游離蒽醌與結(jié)合蒽醌的比例為1∶21。結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 是否浸泡及提取時(shí)間對(duì)結(jié)合蒽醌成分提取的影響

3 討論

近年來(lái)大黃的提取工藝主要有超聲法[8-10]、滲漉法[11-14]、醇提法[15-18]、水提法[19，20]和超臨界CO2萃取法[21，22]等，但超聲法工作噪音較大，對(duì)人體有一定的危害[23]，滲漉法周期長(zhǎng)，工序多，提取效率較低[24]，超臨界CO2萃取法需要專(zhuān)業(yè)的提取儀器，運(yùn)行成本過(guò)高，推廣應(yīng)用困難[25]，故本試驗(yàn)對(duì)醇提法和水提法進(jìn)行了條件篩選。其中關(guān)于煎煮時(shí)間的設(shè)定，因結(jié)合蒽醌受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)被破壞，含量降低，故煎煮時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)[26]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃藥材浸泡前后游離和結(jié)合蒽醌含量差異明顯，如果以提取結(jié)合蒽醌為目的，建議大黃藥材不浸泡提取，浸泡后，提取的游離蒽醌含量較高，推測(cè)是浸泡一段時(shí)間后，大黃中的結(jié)合蒽醌可能部分被水解了。前人有關(guān)于大黃結(jié)合蒽醌的提取[27]，其采用紫外分光光度法測(cè)定結(jié)合蒽醌的含量，因其檢測(cè)手段不夠準(zhǔn)確，且大黃藥材中蒽醌含量高低不一，相較于考查大黃結(jié)合蒽醌的含量，選用高效液相色譜法測(cè)定蒽醌含量進(jìn)而計(jì)算結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率顯然更具有參考價(jià)值。本試驗(yàn)考慮到大黃結(jié)合蒽醌的轉(zhuǎn)移率，游離與結(jié)合蒽醌的比例及成本等因素，對(duì)大黃提取條件進(jìn)行了篩選，最終確定了其提取工藝，為工業(yè)大生產(chǎn)提供參考。

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