外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞在不同階段和不同類型肺癌中的價(jià)值研究

肖鵬，梅家轉(zhuǎn)，李瑞君，白樺，栗敏，劉桂舉鄭州人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，鄭州450003

肺癌是對(duì)人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤中前列，且近年來(lái)均呈逐年上升趨勢(shì)，一直是全球關(guān)注的重點(diǎn)問題。發(fā)病隱匿、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是肺癌重要的死亡原因之一[1-2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是近年提出的一種新概念，是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。大部分CTC可被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，但小部分CTC能夠逃逸并隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至其他部位，形成轉(zhuǎn)移灶，這也是腫瘤轉(zhuǎn)移的至關(guān)重要的組成部分，在腫瘤分期、監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷等方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。不同類型、不同階段的腫瘤，CTC的分布及侵襲能力也不盡相同[3-4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織病理學(xué)分類原則，肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩種類型，非小細(xì)胞肺癌又可以細(xì)分為腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌3種類型[5]。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，肺癌T分期包括T0、Tis、T1（a/b/c）、T2（a/b）、T3和 T4；N 分期包括 N0、N1、N2和N3；M 分期包括 M0和 M1（a/b/c）[6]。本研究擬通過免疫磁珠陰性富集法聯(lián)合免疫細(xì)胞熒光染色法檢測(cè)不同階段、不同類型肺癌患者外周血中CTC的情況，并分析其與患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年2月至2014年2月于鄭州人民醫(yī)院接受治療的148例肺癌患者為肺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及病理診斷等均符合2011版原發(fā)性肺癌診療規(guī)范中關(guān)于肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②入組前均未接受任何抗腫瘤相關(guān)治療；③均首次被診斷為肺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)病理診斷結(jié)果；②合并其他原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤者；③依從性差或有精神疾病者。選取同期于本院接受治療的79例肺部良性疾病患者為肺部良性疾病組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肺部良性疾病的診斷；②臨床所有檢查均排除腫瘤性疾病。另外，選取同期于本院接受體檢的15例健康成人的檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：①全身體檢基本正常；②無(wú)肺癌相關(guān)高危因素。肺癌組患者中，男93例，女55例；年齡21～72歲，平均（45.19±11.03）歲。肺部良性疾病組患者中，男50例，女29例；年齡18～70歲，平均（44.28±10.76）歲。健康對(duì)照組中，男10例，女5例；年齡20～71歲，平均（43.54±12.52）歲。3組對(duì)象的性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器

人抗CD45磁珠抗體試劑盒、鼠抗人CD53單克隆抗體、人藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）均購(gòu)自加拿大Stemcell公司；鼠抗人Pan-CK、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyoid transciiption factor-1，TTF-1）和DAPI單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；FACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 入組前，采集所有入組對(duì)象的外周血7.5 ml，具體操作步驟：選擇肘正中靜脈，嚴(yán)格消毒，采用真空采血管（含EDTA）采集7.5 ml外周血，棄去前端1.5 ml血液，以避免血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞污染血液。在采集后24 h內(nèi)完成外周血CTC的富集，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.2 免疫磁珠陰性富集法捕獲CTC 去除紅細(xì)胞：向7.5 ml外周血中加入紅細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，離心后棄上清，后用10%胎牛血清和含1 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸細(xì)胞。去除白細(xì)胞：富集CTC，遵循試劑盒說明書要求，向重懸細(xì)胞液中添加人抗CD45磁珠抗體去除白細(xì)胞，隨后再次進(jìn)行細(xì)胞重懸。再次去除白細(xì)胞，同時(shí)富集CTC：向細(xì)胞重懸液中添加PE標(biāo)記的鼠抗人CD53單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色，后使用PE陽(yáng)性試劑盒進(jìn)行篩選，完成CTC的富集。具體操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)免疫熒光染色后的CTC參照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行以下操作：將富集后的CTC上機(jī)（流式細(xì)胞儀），并同時(shí)向其中添加FITC標(biāo)記好的鼠抗人Pan-CK、TTF-1和DAPI單克隆抗體，F(xiàn)ACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀鑒定CTC并進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨后采用FlowJo 7.2.5軟件對(duì)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 隨訪方法

采用電話、上門隨訪或門診復(fù)診等方式對(duì)肺癌組患者進(jìn)行隨訪，以了解CTC檢出與未檢出肺癌患者的生存情況，隨訪日期截至患者死亡或2017年2月。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

CTC是CD45抗體陰性，而Pan-CK、TTF-1和DAPI均陽(yáng)性的細(xì)胞。由于健康對(duì)照組和肺部良性疾病組的外周血中也可能存在CTC，故設(shè)定此類CTC的閾值均為1，只有所有外周血CTC數(shù)值＞閾值時(shí)才納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC檢出率的比較

健康對(duì)照組、肺部良性疾病組和肺癌組的CTC檢出率分別為6.67%（1/15）、17.72%（14/79）、93.92%（139/148），3組CTC檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=154.2，P＜0.01）；其中，肺部良性疾病組與健康對(duì)照組的CTC檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.47，P＞0.05）；肺癌組的CTC檢出率明顯高于肺部良性疾病組和健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=135.2、85.6，P＜0.01）。

2.2 CTC檢出率與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、M分期為M1期的肺癌患者的CTC檢出率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、M分期為M0期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而不同性別、年齡、組織學(xué)類型、T分期和N分期的肺癌患者的CTC檢出率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 CTC檢出與未檢出肺癌患者生存率的比較

截至隨訪結(jié)束，CTC檢出肺癌患者的生存率為23.78%，低于CTC未檢出肺癌患者的63.85%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.86，P=0.03）。

3 討論

易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是肺癌作為惡性腫瘤的重要原因之一，嚴(yán)重影響了肺癌患者的治療效果和預(yù)后。有研究顯示，不同類型、不同臨床分期的肺癌，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況也不同，這提示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力與肺癌的類型及臨床分期有關(guān)[9]。相關(guān)研究表明，CTC是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但CTC具有較大的異質(zhì)性，腫瘤類型不同或腫瘤所處的階段不同，其能力和狀態(tài)也不盡相同，僅有小部分CTC可在循環(huán)的外周血中完成轉(zhuǎn)移并定植形成轉(zhuǎn)移灶，因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)外周血中CTC的情況對(duì)臨床腫瘤的治療及預(yù)后判斷具有重要意義[10]。

表1 CTC檢出率與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，CTC的檢測(cè)技術(shù)也在不斷進(jìn)步更新，目前CTC的檢測(cè)技術(shù)主要包括免疫磁性捕獲分離技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)、FISH技術(shù)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和基于微流控芯片的CTC捕獲技術(shù)等，其中免疫組織化學(xué)技術(shù)仍是評(píng)價(jià)CTC檢測(cè)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”[11]。本研究通過免疫磁珠陰性富集法聯(lián)合免疫細(xì)胞熒光染色法（流式細(xì)胞儀檢測(cè)）對(duì)CTC進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示肺癌組、肺部良性疾病組和健康對(duì)照組的CTC檢出率分別為93.92%、17.72%和6.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明該方法在CTC的檢測(cè)上具有較高的敏感度和特異度，這與尹寒露等[12]研究結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、M分期為M1期肺癌患者的CTC檢出率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、M分期為M0期的患者（P＜0.05），這提示CTC檢出率與肺癌患者的臨床分期有關(guān)。這與李晶等[13]研究結(jié)果基本一致，但也有研究認(rèn)為CTC檢出率與肺癌的臨床分期無(wú)關(guān)[14]，推測(cè)其原因可能與研究對(duì)象的納入情況和樣本量有關(guān)。

綜上所述，大部分肺癌中均存在CTC，其檢出率與肺癌的臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，早期檢測(cè)CTC有利于肺癌患者病情的評(píng)估。

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