血清MMP-13和TIMP- 2在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的臨床意義

崔濤，孫立山，王貴江，王麗國

滄州市中心醫(yī)院骨科，河北 滄州061001

骨肉瘤是臨床上比較常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性骨腫瘤的10%，大多數(shù)患者的發(fā)病年齡為10～30歲，嚴重影響了患者的身心健康[1]。骨肉瘤以產(chǎn)生類骨樣梭形細胞為主要特征，易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，嚴重時可導(dǎo)致患者死亡。Harbert等[2]研究發(fā)現(xiàn)，80%的骨肉瘤患者在確診時發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，25%的患者在尸檢時發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤發(fā)病后若不治療，患者的生存時間僅有18～24個月，因此早診斷、早治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，在多種惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）表達水平的高低與腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對MMP-13和TIMP-2的表達水平進行測定將有助于預(yù)測骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究通過檢測MMP-13和TIMP-2在骨肉瘤標本中的表達，探討骨肉瘤轉(zhuǎn)移與MMP-13和TIMP-2的關(guān)系，旨在為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)測提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取滄州市中心醫(yī)院病理科存檔的52例骨肉瘤患者的標本，其中男34例，女18例；年齡9～48歲；部位：肱骨8例，橈骨2例，髂骨1例，股骨23例，脛骨12例，腓骨6例；發(fā)生轉(zhuǎn)移11例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移41例。所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)前均未行放療及化療，每個標本均經(jīng)臨床、病理及放射學(xué)檢查確診。組織學(xué)分型：骨母細胞型20例，其中男13例，女7例，平均年齡（19.12±12.23）歲；纖維母細胞型12例，其中男8例，女4例，平均年齡（22.38±9.48）歲；軟骨母細胞型9例，其中男6例，女3例，平均年齡（23.34±7.69）歲；血管擴張型6例，其中男4例，女2例，平均年齡（21.47±6.67）歲；小細胞型5例，其中男3例，女2例，平均年齡（24.43±5.05）歲。不同組織學(xué)分型骨肉瘤患者的年齡和性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及評價標準

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 將干凈的玻片上涂抹APES防脫片膠，撈取組織切片并標注病歷編號，于60℃恒溫箱中放置1.5 h，使組織與玻片緊密黏附。采用鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物法進行染色，實驗組加入MMP-13或TIMP-2一抗，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，滴加生物素標記的二抗，PBS清洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色10～15 min，蒸餾水洗滌，樹膠封片，采用顯微鏡進行觀察。實驗中陽性對照組采用胰腺癌標本，結(jié)果為陽性；陰性對照組用正常血清代替一抗，結(jié)果為陰性；空白對照組用PBS代替一抗，結(jié)果為陰性。

1.2.2 MMP-13陽性判斷標準 鏡下觀察可見棕黃色顆粒判斷為陽性。每張玻片在高倍鏡下取10個視野，陽性細胞所占百分比＞60%，染色較深，判斷為強陽性（++）；陽性細胞所占百分比為10%～60%，染色一般，判斷為弱陽性（+）；陽性細胞所占百分比＜10%，判斷為陰性（－）。

1.2.3 TIMP- 2陽性判斷標準50%以上腫瘤細胞染色為強陽性（++）；26%～50%腫瘤細胞染色為弱陽性（+），26%以下腫瘤細胞染色為陰性（－）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-13和TIMP- 2在不同組織學(xué)分型骨肉瘤標本中的表達情況

在各種組織學(xué)分型的骨肉瘤標本中均可見到MMP-13有不同程度的表達，其陽性表達率為77.8%～83.3%；而TIMP-2的陽性表達率較低，為30.0%～40.0%。不同組織學(xué)分型骨肉瘤患者的MMP-13和TIMP-2陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 MMP-13和TIMP- 2在不同組織學(xué)分型骨肉瘤標本中的表達情況[ n（%）]

2.2 MMP-13和TIMP- 2在不同性別骨肉瘤患者中的表達情況

MMP-13在男性和女性骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為79.4%和77.8%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TIMP-2在男性和女性骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為32.4%和27.8%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 MMP-13和TIMP- 2在不同性別骨肉瘤患者中的表達情況[ n（%）]

2.3 MMP-13和TIMP- 2在不同部位骨肉瘤患者中的表達情況

MMP-13在上肢、下肢和其他部位骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為80.0%、78.0%和100%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TIMP-2在上肢、下肢和其他部位骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為30.0%、31.7%和0，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 MMP-13和TIMP- 2在不同部位骨肉瘤患者中的表達情況[ n（%）]

2.4 MMP-13和TIMP- 2在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中的表達情況

MMP-13在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為100%和34.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.318，P=0.038）；TIMP-2在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為9.1%和61.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.989，P=0.046）。（表4）

表4 MMP-13和TIMP- 2在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中的表達情況[ n（%）]

3 討論

骨肉瘤轉(zhuǎn)移與多種因素有關(guān)，是一個不斷發(fā)展的過程。有學(xué)者提出，腫瘤轉(zhuǎn)移共分為3個步驟：吸附、溶解和移行[4]。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）密切相關(guān)，因為腫瘤細胞能產(chǎn)生一種蛋白酶降解ECM。研究表明，一些腫瘤細胞亞群對于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移起到至關(guān)重要的作用[5-6]，有些轉(zhuǎn)移能力較強的腫瘤細胞能夠分泌MMP-13和TIMP-2[7-8]。說明MMP-13和TIMP-2在調(diào)節(jié)ECM過程中發(fā)揮重要作用。

研究證明，MMP-13在正常組織中無表達[9]，在腫瘤組織中的表達水平相對較高[10]。Ohtani等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞的細胞質(zhì)中可見少量的MMP-13顆粒，說明腫瘤細胞可能具有吸附MMP-13的能力。目前研究發(fā)現(xiàn)TIMP-2在多種腫瘤組織中均有表達[12]。吳登龍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2在腎癌組織中的表達水平明顯低于正常腎組織。魏群等[14]在對大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TIMP-2在正常組織與腫瘤組織中的表達比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明，在各種組織學(xué)分型的骨肉瘤標本中均可見到MMP-13有不同程度的表達，其陽性表達率為77.8%～83.3%；而TIMP-2的陽性表達率較低，為30.0%～40.0%。MMP-13和TIMP-2的表達情況與骨肉瘤患者的性別無關(guān)（P＞0.05）。以往研究證實，MMP在自然界中廣泛存在，多數(shù)分布在植物及無脊椎動物中，幾乎可以降解ECM的所有成分，MMP也是迄今人類發(fā)現(xiàn)的能夠分解纖維類膠原的唯一酶類[15]。MMP家族可分為5大類共20多種，其中MMP-13對于降解ECM有其獨特的作用[16-18]。在正常組織中，MMP-13無表達或很少表達，而在炎性因子、激素及其他因素的刺激下，其表達水平劇增，這與人體生理病理過程如炎性反應(yīng)、胚胎發(fā)育或腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。TIMP是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抑制MMP活性的一組多功能因子家族。TIMP家族成員根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序分別命名為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP-2作為MMP-2特異性的抑制劑，在控制腫瘤播散轉(zhuǎn)移、組織的修復(fù)與重塑過程中發(fā)揮著重要作用；但對生長的影響，既有直接的生長促進活性，又有生長抑制作用，這可能是由于細胞類型不同所致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-13在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為100%和34.1%，TIMP-2在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者中的陽性表達率分別為9.1%和61.0%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示MMP-13和TIMP-2與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。綜上所述，MMP-13和TIMP-2與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移的指標。

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