微小RNA-451調(diào)控COX- 2等細(xì)胞因子對(duì)人肝癌細(xì)胞株增殖和侵襲能力的影響△

馬松林，謝飛，葉龍，呂洋

荊門市第二人民醫(yī)院普外科，湖北 荊門448000

高復(fù)發(fā)率是影響肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者治療效果的主要因素之一。目前，有研究認(rèn)為腫瘤微環(huán)鏡是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素。研究表明，HCC腫瘤微環(huán)境中環(huán)加氧酶2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）表達(dá)過(guò)量是炎性反應(yīng)的罪魁禍?zhǔn)譡1]。近年來(lái)，有研究表明，microRNA通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移從而影響HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后。微小RNA-451（microRNA-451，miRNA-451）在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯增強(qiáng)[2-4]。miRNA-451表達(dá)下調(diào)后，受其調(diào)控的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（migration inhibition factor，MIF）表達(dá)增加，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[5]。本研究擬以miRNA-451為靶點(diǎn)，探討miRNA-451對(duì)腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子表達(dá)的作用，從而證明miRNA-451在抑制HCC微環(huán)境炎性遞質(zhì)表達(dá)中的調(diào)控作用，為防治HCC的復(fù)發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細(xì)胞株L-02以及人肝細(xì)胞癌的HCCLM-3、MHCC-97H/L、Huh-7、SMMC-7721、HepG-2（惡性程度：HCCLM-3＞MHCC-97H＞MHCC-97L＞Huh-7＞SMMC-7721＞HepG-2）細(xì)胞株均由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院捐贈(zèng)。高糖DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，SYBR?Premix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，7300型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。miRNA-451反轉(zhuǎn)錄引物和RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-451高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建LV-premiRNA-451慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的具體步驟按照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 熒光定量RT-PCR 采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)MIF、MAPK、ERK、COX-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）mRNA和miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC細(xì)胞株，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，取適量的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA于-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行RTPCR。反應(yīng)體系：每管總量為 20.0 μl，SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ10.0 μl，上下游引物各 0.8 μl，模板2.0 μl，滅菌蒸餾水6.4 μl；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參。應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 熒光定量RT-PCR的引物序列

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC-97H細(xì)胞株作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染LV-pre-miRNA-451的MHCC-97H細(xì)胞株作為L(zhǎng)V-pre-miRNA-451組，應(yīng)用不含血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1×106/ml的細(xì)胞懸液，在Transwell上室中加入100 μl的細(xì)胞懸液（細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)需要制備人工基底膜，將Matrigel膠和無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基按照1∶3的比例混合），下室加入600 μl 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后用棉簽擦去杯內(nèi)細(xì)胞，在95%乙醇中固定30 min。下室細(xì)胞在吉姆薩中染色30 min。然后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞2次，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn) 空白對(duì)照組和LV-pre-miRNA-451組細(xì)胞按200/孔分別接種于6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37℃孵箱中培養(yǎng)2周后進(jìn)行吉姆薩染色，同時(shí)光學(xué)顯微鏡下觀察，以≥50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞球作為1個(gè)克隆，并計(jì)算克隆形成率；克隆形成率＝（克隆形成數(shù)目/接種細(xì)胞總數(shù)目）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)HCC細(xì)胞株中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量

HCC細(xì)胞株HCCLM-3中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（0.11±0.01），MHCC-97H中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（0.23±0.01），MHCC-97L中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（0.44±0.03），Huh-7中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（0.55±0.02），SMMC-7721中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（0.74±0.03），HepG2中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（0.70±0.01），與正常肝細(xì)胞株L-02細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 不同HCC細(xì)胞株miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量

2.2 空白對(duì)照組和LV-pre-miRNA-451組miRNA-451的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染72 h后，LV-pre-miRNA-451組miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組上調(diào)了（12.09±0.15）倍（P＜0.05）。

2.3 MHCC-97 H細(xì)胞過(guò)表達(dá)miRNA-451后對(duì)各基因表達(dá)的影響

miRNA-451過(guò)表達(dá)后，MHCC-97H中MIFmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.30±0.13），MAKPmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.68±0.02），ERKmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.48±0.02），COX-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.56±0.01），TGF-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.51±0.02），VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量（0.42±0.02），PGE2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.76±0.03），與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 MHCC-97 H轉(zhuǎn)染LV-pre-miRNA-451后相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)24 h后，LV-pre-miRNA-451組侵襲至Transwell膜背面的細(xì)胞數(shù)量為（53±5）個(gè)，明顯低于空白對(duì)照組的（79±4）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.700，P＜0.01）。

2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

空白對(duì)照組細(xì)胞遷移至Transwell膜背面的細(xì)胞數(shù)量為（34±4）個(gè)，LV-pre-miRNA-451組細(xì)胞遷移至Transwell膜背面的細(xì)胞數(shù)量為（17±4）個(gè)，空白對(duì)照組明顯高于LV-pre-miRNA-451組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

HCC細(xì)胞株MHCC-97H過(guò)表達(dá)miRNA-451后的平板克隆形成率為（15.7±0.5）%，明顯低于空白對(duì)照組細(xì)胞的（27.0±0.4）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.705，P＜0.01）。

3 討論

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤局部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及所分泌的活性介質(zhì)等與腫瘤細(xì)胞共同構(gòu)成的局部?jī)?nèi)環(huán)境，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。COX-2能夠?qū)е履[瘤微環(huán)境中TGF-β、VEGF、PGE2、白細(xì)胞介素-10（IL-10）以及IL-12等因子分泌增加，促使腫瘤復(fù)發(fā)[7-9]。因此，下調(diào)COX-2的表達(dá)對(duì)于減少腫瘤的復(fù)發(fā)具有重要意義。

有研究采用了microRNA芯片技術(shù)，對(duì)術(shù)后早期肝癌復(fù)發(fā)（2年內(nèi)復(fù)發(fā)）患者的癌組織和晚期復(fù)發(fā)（2年后復(fù)發(fā)）患者的癌組織進(jìn)行分析，同時(shí)與正常肝組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)晚期復(fù)發(fā)組中癌組織中miRNA-451表達(dá)較正常肝組織下調(diào)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞株中miRNA-451的表達(dá)與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性行為關(guān)系密切。miRNA-451表達(dá)下調(diào)后，受其調(diào)控的MIF表達(dá)水平升高，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[5]。而在腫瘤微環(huán)境的相關(guān)研究中，有研究表明MIF通過(guò)活化MAPK/ERK信號(hào)通路，最終導(dǎo)致COX-2表達(dá)上調(diào)，使腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[11]。推測(cè)miRNA-451表達(dá)下調(diào)后，MIF表達(dá)水平增高，從而導(dǎo)致COX-2增多，腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致HCC術(shù)后遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)。

本研究通過(guò)HCC細(xì)胞株MHCC-97H過(guò)表達(dá)miRNA-451后發(fā)現(xiàn)，與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的各基因MIF、MAKP、ERK、COX-2、TGF-β、VEGF、PGE2相對(duì)于空白對(duì)照組表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)侵襲和遷移至Transwell膜背面的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于空白對(duì)照組均明顯下降（P＜0.01）；MHCC-97H過(guò)表達(dá)miRNA-451后的平板克隆形成率也明顯低于空白對(duì)照組細(xì)胞（P＜0.01）。因此，miRNA-451在HCC細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，下調(diào)后可能通過(guò)活化MAPK/ERK信號(hào)通路，導(dǎo)致COX-2上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中炎性介質(zhì)TGF-β、VEGF以及PGE2的生成和釋放，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

miRNA-451是抑制HCC腫瘤微環(huán)境炎性反應(yīng)的重要因子，通過(guò)阻斷MIF/MAPK/ERK通路，最終減少COX-2的相對(duì)表達(dá)量，降低腫瘤微環(huán)境中的炎性反應(yīng)，從而減少腫瘤復(fù)發(fā)，為防治HCC的復(fù)發(fā)提供一種新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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