新型高效毛細管電泳整體柱拆分拉米夫定

章冰娜，沈靜茹，舒亞玲，張 思

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國家民委重點實驗室，湖北 武漢 430074)

與傳統(tǒng)的高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)等色譜技術(shù)相比，HPCE由于其分離效率高、溶劑和手性選擇劑用量少和分析時間短等優(yōu)勢獲得了越來越快的發(fā)展和應(yīng)用[1]。近年來，CE在藥物分析中具有較高的應(yīng)用潛力[2]。拉米夫定是臨床應(yīng)用中治療效果較好、較具代表性的核苷類抗病毒藥物之一。該藥有效抑制病毒DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，同時對病毒DNA鏈的合成和延長有競爭性抑制作用。目前多應(yīng)用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和抗艾滋病毒(HIV)的治療[3]。但拉米夫定的右旋體細胞毒性較強，對人體線粒體DNA合成存在抑制作用，會引發(fā)周圍神經(jīng)病變[4]。目前拉米夫定對映異構(gòu)體的分離一般以HPLC和GC為主要方式，可實現(xiàn)對單一對映體的含量測定。Nagasarapu[5]等在反相高效液相色譜(RP-HPLC)上用梯度淋洗模式，進行拉米夫定分散片中活性藥物的含量檢測，在流動相為0.05 mmol/L磷酸緩沖液pH值6.2，有機添加劑為乙腈的條件下，拉米夫定平均保留時間為2.8min，峰面積分離度Rs達0.66。

本文采用雙[-6-氧-(-3-間硝基苯磺?；?丁二酸-1,4-單酯-4-)-]-β-CD(β-CD-F2)手性選擇劑制備新型HPCE手性整體柱，對拉米夫定外消旋體混合物實現(xiàn)手性拆分，并對拆分條件進行優(yōu)化。最佳條件下，拉米夫定外消旋體混合物分離度可達22.02。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

拉米夫定對映體混合物(中國食品藥品檢定研究院)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，超高純，陶氏化學(xué)公司子公司)，磷酸(分析純，天津市科米歐化學(xué)試劑有限公司)，超純水、雙[6-氧-(3-間硝基苯磺酰基-丁二酸-1,4-單酯-4-)]-β-環(huán)糊精(自制)。高效毛細管電泳儀(P/ACE MDQ，美國BECKMAN公司)，酸度計(pHs-3c型，上海偉業(yè)儀器廠)，熔融石英毛細管(河北省永年光纖廠)，電子分析天平(FA2004型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 電泳條件

β-CD-F2整體柱為固定相，Tris-H3PO4緩沖液為流動相，所有溶液經(jīng)過0.22μm微孔濾膜過濾。HPCE儀每次運行前,保證在環(huán)境濕度在60%以下，室溫20℃。先用過濾后的緩沖液頂洗整體柱10min，再加電場洗滌40min左右，重復(fù)上述操作過程，直到基線平穩(wěn)。然后放入拉米夫定樣品在一定條件下自動進樣進行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液pH值的變化對分離情況的影響

在β-CD-F2手性整體柱上，檢測波長270nm，工作電壓18KV，Tris-緩沖液濃度為50mmol/L，拉米夫定對映體混合物濃度2.69×10-3mol/L，室溫20℃，進樣時間5s，進樣壓力0.8psi條件下，改變緩沖液pH值為3.7、4.2、4.7、5.2、5.7時，分離度Rs分別為0、3.75、2.73、8.69和5.72. 緩沖溶液的酸堿度可以有效調(diào)整電遷移和電滲的平衡，從而達到增大目標(biāo)物分離度的目的[6]。在β-CD-F2整體柱上，酸性條件下，Tris-磷酸緩沖液pH值的變化對拉米夫定對映體混合物的響應(yīng)信號、峰形及分離度在pH值4.2～5.7范圍內(nèi)有明顯的影響，存在一個最佳pH值，此時手性物質(zhì)的兩對映體與β-CD-F2形成配合物的絡(luò)合平衡作用相差最大。綜合考慮，選擇pH值5.2為拉米夫定外消旋體拆分在此體系中的最佳分離pH值。

2.2 進樣量的變化對拆分拉米夫定對映體混合物的影響

在2.1條件下，選擇緩沖溶液pH值為5.2，分別進樣2.69×10-3mol/L、0.8psi和5.38×10-4mol/L、0.5psi的拉米夫定對映體混合物，確定后者較為合適，在此條件下，繼續(xù)改變進樣時間分別為3、5、8、10、12s，探究進樣量對拆分拉米夫定對映體混合物的影響，分離結(jié)果顯示最適進樣時間為5s。

2.3 工作電壓的變化對拆分拉米夫定對映體混合物的影響

在2.2的分析條件下，改變工作電壓分別為13、15、18、20、23kV。實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 工作電壓對拉米夫定對映體混合物分離的影響HPCE圖

Fig.1 Effect of voltage on the separation of lamivudine enantiomer

改變工作電壓對電遷移和電滲流有一定的影響，增加工作電壓有利于加快分離速度。拉米夫定兩對映體的保留時間隨著電壓的增大而減小，樣品得以更快的速度洗脫。而兩對映體的洗脫強度和分離度都呈現(xiàn)出一種先上升后下降的趨勢，且20kV時兩峰分離度高達20.02。大于20kV則可能由于電場強度增大，電滲速度加快，使樣品的遷移速度過大導(dǎo)致β-CD-F2與樣品的作用時間縮短從而選擇性降低，或由于焦耳熱過高，使拆分結(jié)果變差。綜合考慮，選擇20kV為當(dāng)前體系中拉米夫定外消旋體拆分的最佳電壓。

2.4 Tris-磷酸緩沖液濃度變化對拆分拉米夫定對映體混合物的影響

在2.3的分析條件下，改變Tris-磷酸緩沖液濃度，分別為30、40、50、60、70 mmol/L。實驗結(jié)果表明，合適的緩沖液濃度對分離的選擇性和分離效率均有較大的影響，過高的緩沖液濃度可能導(dǎo)致焦耳熱增加影響分離[7]。結(jié)合表3數(shù)據(jù)分析可知，隨著緩沖液濃度的增加，拉米夫定兩對映體的保留時間、前峰的洗脫強度均變化不大，然而保留值和后峰的洗脫強度在50 mmol/L與其他濃度相比有明顯的增加。50 mmol/L以后，隨著緩沖液濃度的增加，后峰的洗脫強度又有所減弱。在50 mmol/L時，體系的基線平穩(wěn)。綜合洗脫強度、基線情況以及分離度因素,選擇離子強度適中50 mmol/L時的濃度為當(dāng)前體系的最佳緩沖液濃度。

3 結(jié)語

以β-CD-F2為手性選擇劑制備的HPCE整體柱拆分手性藥物拉米夫定對映體混合物，采用單一變量法，分別研究了Tris-磷酸緩沖液pH值、濃度、進樣量、工作電壓等對拆分拉米夫定對映體混合物的影響。通過對實驗分離條件的選擇優(yōu)化，建立了手性藥物拉米夫定對映體分離分析的HPCE新方法。結(jié)果表明，拉米夫定分子結(jié)構(gòu)中含有羥基、氨基、羰基，有共軛體系的六元氮雜環(huán)和五元硫氧環(huán)及共軛雙鍵等，易與β-環(huán)糊精的親水羥基產(chǎn)生氫鍵作用，拉米夫定及其對映體直線型的分子結(jié)構(gòu)使之易進入β-環(huán)糊精的疏水空腔內(nèi)。β-CD-F2上存在羧基，其與拉米夫定的氨基，羥基產(chǎn)生靜電引力、范德華力、氫鍵作用力，增強了HPCE整體柱的手性識別能力，增強了對拉米夫定對映體的手性拆分能力。通過優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)分析可知，pH值5.20，Tris-磷酸緩沖液濃度為50mmol/L，檢測波長為270nm，柱溫20℃，工作電壓為20kV，進樣時間為5s時，拉米夫定對映體得到了較好的分離，分離度Rs可達到22.02，且拉米夫定外消旋體混合物手性拆分后兩對映體的分離度明顯優(yōu)于已有HPLC拆分的文獻[5]報道結(jié)果。

[1]Zhu Bolin,Xu Shuyin,Guo Xingjie,et al. Use of variousβ-cyclodextrin derivatives as chiral selectors for the enantiomeric separation of ofloxacin and its five related substancesby capillary electrophoresis[J]. J Sep Sci, 2017,40:1784-1795.

[2]Deeb E I,W?tzig S,Abd EI-Hady H,et al. Recent advances in capillary electrophoretic migration techniques for pharmaceutical analysis[J].Electrophoresis,2016,37:1591-1608.

[3]Marrone A,Capoluongo N,D'Amore C.Eighteen‐month lamivudine prophylaxis on preventing occult hepatitis B virus infection reactivation in patients with haematological malignancies receiving immunosuppression therapy[J].J Viral Hepat,2018,25:198-204.

[4]Warren Beach J,Lak S Jeong,Antonio J Alves.Synthesis of enantiomerically pure(2'R,5'5)-(-)-l-[2- (Hydroxymethyl)oxathiolan-5-yl]cytosine as a potent antiviral agent against hepatitis B Virus (HBV) and human immunodeficiency virus (HIV) [J].J Org Chem,1992,57:2217-2219.

[5]Nagasarapu Mallikarjuna Rao,Dannana Gowri Sankar. Development and validation of stability-indicating HPLC method for imeltaneous determination of Lamivudine,Tenofovir,and Dolutegravir in bulk and their tablet dosage form[J]. Future Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,1:73-77.

[6]Wang Shuye,Wang Yiying,Zhou Jie.Mono-6A-(4-methoxybutylamino)-6A-β-cyclodextrin as a chiral selectorfor enantiomeric separation[J].J Sep Sci,2014,37:2056-2061.

[7]Zhou Jie,Wang Yiying,Liu Yun,et al. Methoxypropylamino β-cyclodextrin clicked AC regioisomer for enantioseparations in capillary electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta,2015,868:73-79.