Dectin?1介導(dǎo)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的作用研究

段志敏 杜蕾蕾 劉彩霞 曾榮 沈永年 胡素泉 劉維達(dá) 陳青 李岷

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（段志敏、李岷），中心實(shí)驗(yàn)室（杜蕾蕾），激光科（曾榮），真菌科（沈永年、胡素泉、劉維達(dá)）；南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市第一醫(yī)院皮膚科（劉彩霞）；江蘇省血液中心（陳青）

樹(shù)突細(xì)胞相關(guān)C型凝集素1（Dectin?1）是一種重要的C型凝集素樣受體，能夠特異性識(shí)別β葡聚糖的模式識(shí)別受體（PRR），可在結(jié)合β葡聚糖后激活并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括介導(dǎo)吞噬、活化信號(hào)傳導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生活性氧以及分泌細(xì)胞因子和趨化因子等［1?2］。已有研究證實(shí)，Dectin?1可介導(dǎo)白念珠菌與巨噬細(xì)胞的識(shí)別，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體抗白念珠菌的免疫反應(yīng)［3］。人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP?1）來(lái)源于人原始單核細(xì)胞，常用來(lái)研究單核-巨噬細(xì)胞的功能、信號(hào)傳導(dǎo)通路、代謝情況及吞噬活性等［4］，用丙二醇甲醚醋酸酯（propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA）可誘導(dǎo)分化為成熟巨噬細(xì)胞［5］。本研究觀察巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌情況，探討Dectin?1受體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌的影響。

資料和方法

一、資料

1.細(xì)胞和菌株：THP?1購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）。白念珠菌由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌科提供。

2.主要試劑：鈣熒光白染料（CFW，美國(guó)Sigma?Aldrich公司）；二氫羅丹明（DHR123，德國(guó)Ruibio公司）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國(guó)Bio?rad公司）；PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本Takara公司）；抗人/靈長(zhǎng)類(lèi)Dectin?1 PE抗體（美國(guó)eBioscience公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染：細(xì)胞制備成105/ml細(xì)胞懸液，接種于6孔（每孔2 ml）及12孔（每孔1 ml）細(xì)胞培養(yǎng)板，加入100 μg/L PMA刺激48 h后換液。針對(duì)Dectin?1基因，設(shè)計(jì)并合成特異性siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，編號(hào)為CLEC7A?Homo?335）序列。正向引物：5′?GGGAAUCCUAUGCUUGG UATT?3′，反向引物5′?UACCAAGCAUAGGAUUCCC TT?3′。無(wú)義片段（NC）序列，正向引物：5′?UUCUCC GAACGUGUCACGUTT?3′，反向引物：5′?ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT?3′。以 lipofectamine 2000 為載體轉(zhuǎn)染入THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。

2.菌株制備與染色：以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，最終配制成108CFU/ml菌懸液，置于水浴鍋內(nèi)56℃30 min滅活。滅活白念珠菌菌懸液以0.1 mg/ml CFW室溫染色30 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察。CFW可與真菌細(xì)胞壁多糖成分結(jié)合，染色后真菌輪廓在紫外線下呈藍(lán)色。白念珠菌孢子與DHR123（30μmol/L）于37℃孵育30 min，離心，PBS洗滌后熱滅活，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬率。CFW及DHR123為常用微生物染色劑，不影響微生物吞噬過(guò)程［6?7］。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Dectin?1 mRNA表達(dá)：將轉(zhuǎn)染siRNA 24 h的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞以TRIzol法提取總RNA，按Prime Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI7300 PCR儀，采用SYBR Green法擴(kuò)增目的基因。β肌動(dòng)蛋白和Dectin?1引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。β肌動(dòng)蛋白引物序列，正向5′?TCTGGCA CCACACCTTCTA?3′，反向5′?AGGCATACAGGGACA GCAC?3；Dectin?1引物序列，正向 5′?GGAAGCAAC ACATTGGAGAATGG?3，反向 5′?CTTTGGTAGGAGTC ACACTGTC?3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，變性95℃15 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)數(shù)40。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，得到基因Ct值，結(jié)果按2?ΔΔCt計(jì)算，得到Dectin?1與β肌動(dòng)蛋白基因相對(duì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Dectin?1蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染siRNA 24 h THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞重懸于100 μl PBS中，每孔加入5 μl Dectin?1 PE流式抗體，4 ℃孵育30 min；以PBS洗滌2次，振蕩混勻，懸浮在200 μl PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每份樣品收集10 000個(gè)細(xì)胞，通過(guò)FSC/SSC設(shè)門(mén)。采用Flow Jo軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)門(mén)內(nèi)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

5.siRNA干擾Dectin?1后THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)白念珠菌吞噬檢測(cè)：轉(zhuǎn)染siRNA的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與CFW染色的白念珠菌以1∶10比例共培養(yǎng)1、2、4 h。用PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察、拍照。分別選擇×40倍10個(gè)視野，計(jì)算吞噬率，吞噬率=吞噬白念珠菌的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%；吞噬≥3個(gè)白念珠菌的細(xì)胞百分比=吞噬≥3個(gè)白念珠菌的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。將轉(zhuǎn)染siRNA的THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與DHR123標(biāo)記白念珠菌以1∶10共培養(yǎng)30 min、1 h、2 h、4 h，用PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示。不同處理間mRNA表達(dá)水平比較采用單因素方差分析，并采用LSD?t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。采用FlowJo7.6.2軟件分析細(xì)胞表面Dectin?1的MFI及吞噬后DHR123的MFI，以±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA?Dectin?1后Dectin?1 mRNA及蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染siRNA?Dectin?1后Dectin?1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.26±0.02，和轉(zhuǎn)染NC相比（1.0±0.02）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.163，P＜0.001）。轉(zhuǎn)染NC與siRNA?Dectin?1后，Dectin?1蛋白表達(dá)量（MFI）分別為38.44±0.43、20.34±0.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.03，P＜0.001）。

表1 siRNA干擾Dectin?1對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的影響（±s）

表1 siRNA干擾Dectin?1對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的影響（±s）

注：n=3

組別 吞噬率（%）無(wú)義片段組siRNA?Dectin?1組t值P值刺激后1 h 22.1±0.2 17.5±0.1 23.95＜0.05刺激后2 h 24.3±0.2 18.6±0.2 20.66＜0.01刺激后4 h 59.1±0.3 39.2±0.2 54.08＜0.01吞噬≥3個(gè)菌的細(xì)胞百分比（%）刺激后1 h 4.7±0.1 2.2±0.1 15.01＜0.01刺激后2 h 5.4±0.2 2.5±0.1 17.30＜0.01刺激后4 h 8.3±0.4 5.1±0.2 24.40＜0.01

二、熒光顯微鏡下觀察siRNA干擾Dectin?1對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的影響

THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后與滅活白念珠菌共培養(yǎng)1、2、4 h后，吞噬率、吞噬≥3個(gè)菌細(xì)胞百分比明顯降低（表1）。以預(yù)先用CFW染色后白念珠菌與THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞共培養(yǎng)，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞將白念珠菌吞入胞內(nèi)（圖1）。

三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA干擾Dectin?1對(duì)THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的影響

圖1 熒光顯微鏡下無(wú)義片段組與白念珠菌培養(yǎng)2 h（×100） 可見(jiàn)白念珠菌（藍(lán)色熒光）被THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞入胞內(nèi)

圖2 DHR123染色前后流式細(xì)胞儀檢測(cè)白念珠菌孢子的熒光強(qiáng)度變化

表2 轉(zhuǎn)染siRNA?Dectin?1后THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的平均熒光強(qiáng)度（MFI）（±s）

表2 轉(zhuǎn)染siRNA?Dectin?1后THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌的平均熒光強(qiáng)度（MFI）（±s）

注：n=3

組別無(wú)義片段組siRNA?Dectin?1組t值P值刺激后30 min 45.7±0.35 36.8±0.19 22.348＜0.05刺激后1 h 62.4±0.42 54.3±0.23 16.915＜0.05刺激后2 h 84.9±0.39 72.1±0.29 24.836＜0.05刺激后4 h 116.7±0.67 93.6±0.55 26.649＜0.05

DHR123染色白念珠菌后，90%孢子熒光陽(yáng)性（圖2）。轉(zhuǎn)染siRNA?Dectin?1后THP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞吞噬白念珠菌每組平均熒光強(qiáng)度與轉(zhuǎn)染NC相比降低，P＜ 0.05（表2）。

討 論

吞噬作用屬于一種保守的固有免疫反應(yīng)，對(duì)于病原微生物的殺傷、清除以及啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)都具有重要作用。吞噬作用依賴于細(xì)胞表面吞噬相關(guān)受體，如Dectin?1受體、甘露糖受體（MR）、清道夫受體等；受體與配體結(jié)合并活化，介導(dǎo)吞噬反應(yīng)。

機(jī)體對(duì)白念珠菌吞噬作用構(gòu)成了抗白念珠菌感染第一道防線，目前已報(bào)道多種受體參與介導(dǎo)對(duì)白念珠菌的吞噬，如Dectin?1、MR、補(bǔ)體受體等［1］。Dectin?1受體作為一種重要的與β葡聚糖高親和力結(jié)合的PRR，在抗白念珠菌感染方面作用突出，研究廣泛。然而，既往研究多以單獨(dú)白念珠菌細(xì)胞壁成分進(jìn)行研究，不能準(zhǔn)確反映出白念珠菌孢子刺激機(jī)體后出現(xiàn)的吞噬效應(yīng)。本研究通過(guò)siRNA干擾Dectin?1受體表達(dá)，以熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀兩種方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞在干擾Dectin?1受體表達(dá)前后對(duì)白念珠菌吞噬效應(yīng)，從整體角度闡述Dectin?1受體在白念珠菌感染后的吞噬效應(yīng)中所發(fā)揮的作用。

Dectin?1與β葡聚糖結(jié)合后，刺激信號(hào)通過(guò)Dectin?1的跨膜桿狀結(jié)構(gòu)使細(xì)胞質(zhì)側(cè)的ITAM磷酸化，再通過(guò)活化Dectin?1-脾臟酪氨酸激酶（Syk）-胱冬肽酶募集結(jié)構(gòu)域9（CARD9）信號(hào)傳導(dǎo)途徑、絲氨酸-蘇氨酸激酶-1（Raf?1）信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)［3?5］，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子、趨化因子［8］。同時(shí)作為一種吞噬受體，Dectin?1能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬酵母相的白念珠菌［4］。已有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷對(duì)β葡聚糖的吞噬作用會(huì)引起增強(qiáng)且持久的炎癥反應(yīng)，提示Dectin?1受體所介導(dǎo)的吞噬作用不僅在清除外來(lái)病原體方面起作用，而且可以調(diào)控β葡聚糖引起的下游炎癥反應(yīng)［8］。在本研究中，通過(guò)為T(mén)HP?1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)染Dectin?1受體siRNA，經(jīng)mRNA與蛋白水平驗(yàn)證，Dectin?1受體表達(dá)水平明顯降低，證明轉(zhuǎn)染成功。在干擾了Dectin?1受體表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其對(duì)白念珠菌吞噬水平較轉(zhuǎn)染無(wú)義片段組明顯降低，提示Dectin?1受體在巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌的效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，降低Dectin?1水平的表達(dá)將減少對(duì)白念珠菌清除。

本研究結(jié)果顯示，在明顯降低Dectin?1受體表達(dá)水平后，巨噬細(xì)胞對(duì)白念珠菌仍有一定水平吞噬效應(yīng)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，吞噬效應(yīng)逐漸增加，提示在減少或缺乏Dectin?1受體表達(dá)情況下，其他受體仍然可以介導(dǎo)對(duì)白念珠菌吞噬效應(yīng)。已報(bào)道β葡聚糖可以直接活化補(bǔ)體旁路途徑介導(dǎo)吞噬效應(yīng)［9?10］；白念珠菌細(xì)胞壁的甘露聚糖成分可與MR結(jié)合并誘導(dǎo)激活發(fā)揮吞噬功能［11?12］，因此，巨噬細(xì)胞對(duì)白念珠菌吞噬作用與多個(gè)受體聯(lián)合作用相關(guān)。通過(guò)提高Dectin?1活化水平，可能會(huì)提高對(duì)白念珠菌感染控制水平；從而為臨床上抗白念珠菌感染提供新的防治思路。

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