程序性細(xì)胞死亡因子4與5-氟尿嘧啶對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用

馬剛，劉寧，徐亮，劉哲，宋從浩，王丹璞

（1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院普通外科，沈陽(yáng) 110001； 2. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通外科，?？?570100）

胰腺癌惡性度高，進(jìn)展快，5年生存率低，僅為5%～10%，中位生存期約為診斷后5～6個(gè)月[1]。其在世界范圍內(nèi)占惡性腫瘤死亡原因的第4位[2]，在我國(guó)為第7位[3-4]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和外科醫(yī)生手術(shù)技術(shù)的提高，部分以前被認(rèn)為不能手術(shù)切除的胰腺癌如今已經(jīng)可以進(jìn)行根治性切除。雖然手術(shù)切除率不斷提高，但患者的生存時(shí)間卻未得到相應(yīng)的明顯改善。因此對(duì)于胰腺癌，除了繼續(xù)提高手術(shù)療效以外，以化療為主的多學(xué)科綜合治療倍受重視和關(guān)注，期望能夠找到更多有效的辦法改善胰腺癌的預(yù)后。

5-氟尿嘧啶 （5-fluorouracil，5-FU） 是應(yīng)用最早、最廣泛的胰腺癌化療用藥，它通過(guò)改變細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞的作用。但其總體反應(yīng)率僅為20%，影響胰腺癌對(duì)化療藥物不敏感、產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一就是各種原因?qū)е碌牡蛲鲆种啤１菊n題組的前期研究[5]結(jié)果表明，程序性細(xì)胞死亡因子4 （programmed cell death factor 4，PDCD4）作為一種抑癌基因，能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制包括胰腺癌在內(nèi)的消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究探討了PDCD4對(duì)5-FU誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)PDCD4可以增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用，兩者具有協(xié)同作用。這一結(jié)果為胰腺癌的綜合治療提供了新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、G418（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶、二甲基亞砜 （DMSO）（美國(guó)Sigma公司），四甲基偶氮唑鹽 （MTT）、5×SDSPAGE （江蘇碧云天公司），Lipafectamine 2000高效轉(zhuǎn)染試劑盒 （美國(guó) Invirtogen公司），PDCD4蛋白抗體、PDCD4表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-N1/PDCD4及空載體質(zhì)粒PEGFP-N2 （日本佐賀大學(xué)醫(yī)學(xué)部代謝內(nèi)分泌研究室松橋幸子教授惠贈(zèng)），細(xì)胞色素C （cytochrome C，CytC） 抗體 （美國(guó)Santa Cruz公司） 。

1.1.3 主要儀器：CO2孵育箱、酶標(biāo)儀、倒置顯微鏡、高速離心機(jī)、普通瓊脂糖凝膠電泳儀 （北京六一） 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 （含100 U/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素） 中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，2 d換液1次，3～4 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合時(shí)，應(yīng)用Lipafectamine 2000高效轉(zhuǎn)染試劑盒 （美國(guó)Invirtogen公司） 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒PEGFP-N2 （vector） ；轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染PEGFP-N1/PDCD4。轉(zhuǎn)染過(guò)程按照試劑操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 5-FU處理：轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，依次加入10、50、100、500 μ g/mL的5-FU，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞抑制率：將上述處理的細(xì)胞每孔加入20 μ L MTT （5 mg/mL） ，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μ L DMSO溶解，振蕩混勻后，以酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度 （A） 值，計(jì)算抑制率。設(shè)立陰性對(duì)照組：完全培養(yǎng)液加等量無(wú)水PBS作為空白對(duì)照。計(jì)算公式：抑制率 （%） = （A對(duì)照組-A轉(zhuǎn)染組） /A對(duì)照組×100，繪制生長(zhǎng)抑制曲線。

1.2.5 熒光顯微鏡進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)：將經(jīng)過(guò)5-FU處理的細(xì)胞，應(yīng)用5 μ g/mL Hoechst 33342染色5 min，熒光顯微鏡下觀察染色細(xì)胞。凋亡細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)呈濃縮狀態(tài)或細(xì)胞核裂解為碎塊。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)PDCD4和CytC的蛋白表達(dá)：將經(jīng)過(guò)5-FU處理的細(xì)胞，以1∶5比例加入蛋白裂解液，充分裂解，4 ℃、12000 r/min離心1 h，收集上清液并測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加入特異性一抗兔抗人PDCD4抗體（1∶6000） 、兔抗人細(xì)胞色素C抗體 （1∶500） 、β-actin抗體 （1∶1000） ，4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光、顯像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 5-FU和PDCD4對(duì)胰腺癌細(xì)胞存活率的協(xié)同效應(yīng)

應(yīng)用5-FU處理的轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制。隨著5-FU濃度的增加，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均明顯升高 （P> 0.05） ；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組內(nèi)不同濃度5-FU間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P> 0.05） 。表明5-FU具有抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，該作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。在相同濃度5-FU作用下，轉(zhuǎn)染組比對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用顯著增強(qiáng) （P> 0.05） 。應(yīng)用500 μ g/mL的5-FU 處理后，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為46.2%，而同時(shí)轉(zhuǎn)染了PDCD4的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率則達(dá)到72.1%。說(shuō)明轉(zhuǎn)染PDCD4能夠增強(qiáng)5-FU的抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。見(jiàn)表1。

2.2 5-FU和PDCD4對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的協(xié)同效應(yīng)

應(yīng)用5-FU處理的轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均顯著增加 （P< 0.05） ；經(jīng)LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除500 μ g/mL與100 μ g/mL 5-FU間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組內(nèi)各濃度5-FU間細(xì)胞凋亡率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P< 0.05） 。表明5-FU能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，且至濃度達(dá)到100 μ g/mL時(shí)，作用隨著濃度的增高而顯著增強(qiáng)。在相同濃度5-FU作用下，轉(zhuǎn)染組比對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P< 0.05） 。說(shuō)明轉(zhuǎn)染PDCD4增強(qiáng)了5-FU誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度5-FU作用下轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率及CytC蛋白表達(dá)（±s，n = 3）Tab.1 Effect of different concentrations of 5-FU on the growth inhibition rate，percentage of apoptotic cells，and expression of CytC protein in PDCD4 transfected and non-transfected pancreatic cancer cells （±s，n = 3）

表1 不同濃度5-FU作用下轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率及CytC蛋白表達(dá)（±s，n = 3）Tab.1 Effect of different concentrations of 5-FU on the growth inhibition rate，percentage of apoptotic cells，and expression of CytC protein in PDCD4 transfected and non-transfected pancreatic cancer cells （±s，n = 3）

1） P < 0.05 vs control group；2） P < 0.05 vs 0 μ g/mL 5-FU；3） P < 0.05 vs 10 μ g/mL 5-FU；4） P < 0.05 vs 50 μ g/mL 5-FU；5） P < 0.05 vs 100 μ g/mL 5-FU.

Growth inhibition rate （%） Percentage of apoptotic cells （%） Grey value of expression of CytC protein Transfection group Control group Transfection group Control group Transfection group Control group 0 7.2±0.641） 2.7±0.30 5.2±0.801） 2.1±0.37 0.3±0.011） 0.1±0.0010 8.8±0.811），2） 6.2±0.672） 18.3±2.941），2） 12.4±2.272） 0.9±0.021），2） 0.3±0.012）50 19.3±1.131），2），3） 11.5±1.312），3） 40.5±3.991），2），3） 22.1±4.652），3） 1.1±0.021），2） 0.6±0.012）100 52.6±5.501），2），3），4） 22.3±2.052），3），4） 63.2±10.821），2），3），4） 38.4±5.152），3），4） 0.8±0.031），2） 0.2±0.014）500 72.1±7.351），2），3），4），5） 46.2±5.872），3），4），5） 70.7±13.221），2），3），4） 45.5±8.062），3），4） 1.2±0.021），2），5） 0.4±0.032）5-FU（μg/mL）

2.3 5-FU和PDCD4對(duì)胰腺癌細(xì)胞CytC的蛋白表達(dá)的影響

應(yīng)用不同濃度5-FU處理的轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞CytC均有表達(dá)。轉(zhuǎn)染組內(nèi)經(jīng)5-FU處理后CytC蛋白的表達(dá)均顯著高于0 μ g/mL （P< 0.05） ，但不同5-FU濃度間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P> 0.05） ；對(duì)照組內(nèi)，除100 μ g/mL濃度外，各濃度5-FU均顯著高于0 μ g/mL （P<0.05） ，不同濃度5-FU間，僅50 μ g/mL與100 μ g/mL 5-FU間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P< 0.05） ，其余各濃度間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明5-FU能夠使CytC蛋白表達(dá)增高，但增高程度與5-FU濃度無(wú)關(guān)。在相同濃度5-FU作用下，轉(zhuǎn)染組比對(duì)照組細(xì)胞CytC表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P< 0.05） 。說(shuō)明轉(zhuǎn)染了PDCD4的胰腺癌細(xì)胞，可能通過(guò)線粒體中CytC的釋放，增強(qiáng)了5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。見(jiàn)表1。

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，胰腺外科迎來(lái)了精準(zhǔn)治療的時(shí)代。2D、3D腹腔鏡以及達(dá)芬奇機(jī)器人手術(shù)系統(tǒng)的全面應(yīng)用，使胰腺癌的手術(shù)切除率不斷提升，并且達(dá)到了微創(chuàng)化、精準(zhǔn)化，圍手術(shù)期死亡率不斷下降。但至今患者的5年生存率并未得到相應(yīng)的改善，目前患者的5年生存率仍維持在7%左右[1]。因此，以化療為主的多學(xué)科綜合治療成為胰腺癌治療的重要途徑，但化療藥物的耐藥是目前影響化療效果的主要原因。

5-FU和吉西他濱是應(yīng)用于胰腺癌治療的主要化療用藥，近來(lái)研究多數(shù)集中在吉西他濱的耐藥上，對(duì)于應(yīng)用最早、最廣泛的5-FU研究較少。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染PDCD4進(jìn)入胰腺癌PANC-1細(xì)胞，明確其對(duì)5-FU對(duì)胰腺癌效應(yīng)的影響。研究結(jié)果證明，5-FU能夠使細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，增加凋亡細(xì)胞。通過(guò)比較PDCD4轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同濃度5-FU的作用下，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)受到更明顯的抑制，凋亡細(xì)胞增加程度更為顯著；且隨著5-FU濃度的升高，對(duì)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的抑制作用和促進(jìn)凋亡作用增強(qiáng)程度更為突出。說(shuō)明PDCD4能夠增強(qiáng)5-FU的誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。在相同濃度5-FU處理的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染組比對(duì)照組CytC表達(dá)明顯升高?？梢酝茰y(cè)，PDCD4可能通過(guò)線粒體途徑，促進(jìn)原來(lái)存在于線粒體膜間隙中的CytC釋放入細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中CytC表達(dá)增高。釋放的CytC與Apaf-1和caspase 9的復(fù)合物形成凋亡體，進(jìn)而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究表明，PDCD4在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)下降，轉(zhuǎn)染了PDCD4表達(dá)質(zhì)粒的胰腺癌細(xì)胞，可能通過(guò)線粒體途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，并且能夠增強(qiáng)5-FU的誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的的作用。

microRNA （miRNA） 是一組長(zhǎng)度為17～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，具有調(diào)控特定基因表達(dá)的作用，從而影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，發(fā)揮類似原癌基因或抑癌基因的效應(yīng)[6]。有研究[7-9]表明，miRNA可抑制PDCD4表達(dá)，從而降低了胃癌、食道癌、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞的凋亡。microRNA-21可以通過(guò)下調(diào)PDCD4表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)其對(duì)5-FU的耐藥[10]。而應(yīng)用反義microRNA-21，則可上調(diào)PDCD4表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)，聯(lián)合應(yīng)用吉西他濱可以誘導(dǎo)更多細(xì)胞凋亡，兩者可起到抗腫瘤的協(xié)同作用[11]。

這些研究結(jié)果均表明，PDCD4作為一個(gè)抑癌基因，一旦在胰腺癌細(xì)胞中重獲表達(dá)，再聯(lián)合應(yīng)用5-FU等化療藥物，將發(fā)揮其對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，直接促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，這將對(duì)胰腺癌的臨床治療提供新的方法。本研究找到了一個(gè)胰腺癌基因治療的切入點(diǎn)，提供了一個(gè)抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的新思路。

隨著研究的不斷開(kāi)展，胰腺癌的治療也在不斷的改進(jìn)。最近有學(xué)者提出，結(jié)合腫瘤標(biāo)志物CA199、CA125、CEA等檢測(cè)，并結(jié)合術(shù)前新輔助化療對(duì)腫瘤標(biāo)志物的影響，可以有效判斷患者的預(yù)后。以此進(jìn)一步篩選患者，明確可從手術(shù)中獲益的患者和即使做了根治性手術(shù)術(shù)后也將很快復(fù)發(fā)、不會(huì)改善預(yù)后的患者，進(jìn)而采取針對(duì)性治療方案。PDCD4作為一個(gè)抑癌基因，同樣可能成為一個(gè)預(yù)后因子，結(jié)合這些指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，有助于更準(zhǔn)確地判斷患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床決策，使更多患者受益，應(yīng)該作為今后研究的焦點(diǎn)。

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