流加補料技術(shù)在大觀霉素發(fā)酵中的應(yīng)用

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(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司,浙江 金華 321016)

大觀霉素(Spectinomycin)是由壯觀鏈霉菌(Streptomycesspectabilis)產(chǎn)生的一種氨基糖甙類抗生素,廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè).其硫酸鹽是一種安全、高效、廣譜新型獸藥[1].2000年后國內(nèi)陸續(xù)開展壯觀鏈霉菌菌種選育工作,菌株生產(chǎn)能力獲得大幅提高[2-4],例如夏云重等利用基因組重排技術(shù)和傳統(tǒng)誘變技術(shù),篩選到一株大觀霉素高產(chǎn)菌株[5].目前大觀霉素發(fā)酵生產(chǎn)采用間歇補加全料工藝,發(fā)酵單位5 000～6 000 U/mL,流加補料工藝國內(nèi)未見相關(guān)報道.由于壯觀鏈霉菌的生長期與生產(chǎn)期對所需營養(yǎng)及環(huán)境要求不同,間歇補加全料引起營養(yǎng)和環(huán)境的劇烈波動,導(dǎo)致發(fā)酵后期pH和氨基氮回升過快、菌絲早衰自溶、大觀霉素合成速率降低,最終影響了發(fā)酵后期大觀霉素發(fā)酵生產(chǎn).

筆者針對大觀霉素間歇補加全料發(fā)酵工藝存在的問題,通過發(fā)酵過程連續(xù)補料,均衡生長和生物合成的營養(yǎng),將發(fā)酵液溶氧、溫度、pH控制在大觀霉素生物合成的最適范圍內(nèi),結(jié)合發(fā)酵液待放方式,建立了發(fā)酵新工藝,較大幅度地提高了大觀霉素發(fā)酵水平.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

菌種:壯觀鏈霉菌(Streptomycesspectabilis)1012,浙江金華康恩貝生物制藥有限公司研發(fā)中心保藏;檢定菌:克雷伯氏肺炎桿菌,浙江金華康恩貝生物制藥有限公司質(zhì)量保證部保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g/L,酵母膏15 g/L,KNO31 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,瓊脂20 g/L;pH自然,121 ℃滅菌30 min.

種子培養(yǎng)基:糊精20 g/L,葡萄糖10 g/L,豆粕粉30 g/L,酵母粉5 g/L,K2HPO42 g/L,CaCO32 g/L;pH自然,121 ℃滅菌30 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精45 g/L,葡萄糖5 g/L,豆粕粉25 g/L,酵母粉5 g/L,K2HPO42 g/L,(NH4)2SO43 g/L,CaCO32 g/L,豆油3 g/L,PPE聚醚消泡劑0.1 g/L;pH 6.8～7.2,121 ℃滅菌30 min.

補料培養(yǎng)基:糊精400 g/L,(NH4)2SO415 g/L,分別121 ℃滅菌30 min;工業(yè)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH(7.30±0.02).

1.2 方 法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)條件

1) 斜面培養(yǎng)條件:用壯觀鏈霉菌1012冷凍孢子液,在空白斜面劃線接種,28 ℃培養(yǎng)6 d.

2) 種子瓶培養(yǎng)條件:將成熟斜面挖塊5×20 mm,接種到80 mL種子培養(yǎng)液中(750 mL圓底三角瓶),搖瓶機轉(zhuǎn)速220 r/min,30 ℃培養(yǎng)48 h.

3) 發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件:按8%接種量將種子液接種到80 mL種子培養(yǎng)液中(750 mL圓底三角瓶),搖瓶機轉(zhuǎn)速220 r/min,32 ℃培養(yǎng)120 h.

1.2.2 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

1) 種子罐培養(yǎng)條件:15 L發(fā)酵罐,裝液量9 L,接種量0.2%,罐壓0.05 MPa,攪拌轉(zhuǎn)速350～400 r/min,30 ℃培養(yǎng)48 h.

2) 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件:50 L發(fā)酵罐,裝液量33 L,接種量8%,32 ℃培養(yǎng)(0～48 h),30 ℃培養(yǎng)(48～168 h),罐壓0.05 MPa,攪拌轉(zhuǎn)速300～500 r/min,空氣量15～35 L/min,發(fā)酵周期168 h.

1.2.3 60 t發(fā)酵罐發(fā)酵條件

1) 一級種子罐培養(yǎng)條件:3.3 t發(fā)酵罐,裝液量0.9 t,接種量0.2%,培養(yǎng)溫度30 ℃,培養(yǎng)時間48 h,罐壓0.05 MPa,空氣量0.5～0.9 m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速150～220 r/min.

2) 二級種子罐培養(yǎng)條件:10 t發(fā)酵罐,裝液量5 t,接種量10%,培養(yǎng)溫度30 ℃,培養(yǎng)時間24 h,罐壓0.05 MPa,空氣量3～5 m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速120～180 r/min.

3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件:60 t發(fā)酵罐,裝液量40 t,接種量8%,32 ℃培養(yǎng)(0～48 h),30 ℃培養(yǎng)(48～168 h),培養(yǎng)時間168 h,罐壓0.03 MPa,空氣量15～48 m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速80～130 r/min.

1.2.4 補料方法

1) 間歇補料:發(fā)酵27 h后,每12 h間歇補料1 次,控制發(fā)酵液殘?zhí)菨舛戎鸩浇档?

2) 流加補料:發(fā)酵27 h后,流加40%糊精溶液,控制發(fā)酵液殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(15.0±0.5)g/L;流加15%硫酸銨溶液,控制銨態(tài)氮質(zhì)量濃度為0.04～0.06 g/L;氨水控制pH為7.30±0.05.

1.2.4 相關(guān)參數(shù)測定

1) 大觀霉素生物效價測定:管碟法[6].

2) 其他參數(shù)的測定:斐林試劑法測定總糖[6],甲醛法測定氨基氮[6].

3) 菌絲形態(tài):美蘭染色,光學(xué)顯微鏡觀察法.

4) 生物量測定:10 mL發(fā)酵液,3 000 r/min離心15 min,倒出上清液,計算沉降物占發(fā)酵液的百分比.

5) 總產(chǎn)量計算方法:發(fā)酵產(chǎn)量(U)=放罐效價(U/mL)×放罐體積(m3)×106.

2 結(jié)果與分析

2.1 變溫發(fā)酵對大觀霉素生物合成影響

為確定壯觀鏈霉菌1012生物合成大觀霉素的最適溫度,以1.1.2培養(yǎng)基配方,1.2.1培養(yǎng)條件,進行發(fā)酵實驗.發(fā)酵周期0～48 h控制培養(yǎng)溫度32 ℃,48～120 h分別考察培養(yǎng)溫度28,30,32,34 ℃對發(fā)酵生物效價影響,結(jié)果見圖1.各取培養(yǎng)溫度30 ℃(120 h),32 ℃(120 h)的發(fā)酵液美蘭染色,制備菌絲涂片,以1 500 倍光學(xué)顯微鏡觀察菌絲生長情況,結(jié)果見圖2.

圖1 溫度對大觀霉素生物合成的影響 Fig.1 Effect of temperature on biosynthesis of spectinomycin by Streptomyces spectabilis

圖2 溫度對壯觀鏈霉菌菌體形態(tài)的影響(15×100)Fig.2 Effect of temperature on mycelia morphology of Streptomyces spectabilis(15×100)

由圖1,2可知:發(fā)酵周期48～120 h,培養(yǎng)溫度降至30 ℃,生物效價比32 ℃高5.1%;30 ℃培養(yǎng)120 h的發(fā)酵液菌絲比32 ℃更健壯.可見壯觀鏈霉菌生物合成大觀霉素的最適溫度為30 ℃,發(fā)酵溫度可采用前期32 ℃培養(yǎng),有利于菌體生長,48 h后30 ℃培養(yǎng),可減緩壯觀鏈霉菌的衰老,利于生物效價的提高.

2.2 流加補料工藝對大觀霉素合成的影響

將間歇補加全料的大觀霉素發(fā)酵過程的工藝參數(shù)作圖分析,結(jié)果見圖3,4.

圖3 間歇補料發(fā)酵過程參數(shù)曲線Fig.3 Profiles of parameters during batch feeding fermentation process

圖4 間歇補料發(fā)酵過程pH、溶解氧濃度曲線 Fig.4 Profiles of dissolved oxygen concentration and pH during batch feeding fermentation process

分析圖3,4可知:發(fā)酵過程27 h后,每12 h間歇補料后均導(dǎo)致溶氧濃度急劇變化,說明補入營養(yǎng)基質(zhì)濃度過高,菌體呼吸強度增大,導(dǎo)致溶解氧濃度快速降低,造成生物合成環(huán)境劇烈波動;84 h后氨基氮和pH上升較快,120 h發(fā)酵液pH達8.12,氨基氮升至1.2 g/L,部分菌絲自溶,大觀霉素生物合成速率由96 h的57 U/(mL·h),下降到120 h的23 U/(mL·h),說明發(fā)酵后期營養(yǎng)和工藝條件已不適合壯觀鏈霉菌合成大觀霉素.

采用50 L自控發(fā)酵罐,培養(yǎng)基裝量體積33 L,以1.1.2配制培養(yǎng)基,通過蠕動泵流加糊精溶液,控制發(fā)酵液殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(15±0.5) g/L,流加硫酸銨溶液,控制銨態(tài)氮質(zhì)量濃度0.04～0.06 g/L,工業(yè)氨水控制pH(7.3±0.05),發(fā)酵培養(yǎng)120 h,每12 h取樣分析,按1.2.3進行相關(guān)參數(shù)測定.連續(xù)補料3 批研究結(jié)果見表1.

分別取間歇補全料和流加補料發(fā)酵培養(yǎng)120 h發(fā)酵液,美蘭染色,制備菌絲涂片,1 500 倍光學(xué)顯微鏡觀察菌絲生長,結(jié)果見圖5.

表1 50 L發(fā)酵罐連續(xù)補料工藝對大觀霉素合成的影響Table 1 Effect of continuous feeding process on biosynthesis of spectinomycin in 50 L fermentator

圖5 流加補料發(fā)酵工藝對菌絲形態(tài)的影響(15×100)Fig.5 Effect of flow feeding fermentation process on speciation of Streptomyces spectabilis(15×100)

由圖5可知:采用流加補料工藝與間歇補全料發(fā)酵液的菌絲形態(tài)有明顯改變,菌絲分節(jié)變短,空泡增多,有利于提高大觀霉素發(fā)酵水平.

取表1中效價最高的序號2發(fā)酵批次的發(fā)酵過程參數(shù)作曲線圖,見圖6.

由圖6可知:采用流加補料技術(shù),發(fā)酵周期36 h后,發(fā)酵液pH基本維持在7.3左右,溶解氧濃度波動幅度減小;發(fā)酵周期96～120 h間大觀霉素合成速率仍保持60 U/(mL·h),與發(fā)酵周期72～96 h間大觀霉素合成速率64 U/(mL·h)下降不顯著,解決了原工藝后期大觀霉素合成量減少的問題.

圖6 流加補料發(fā)酵過程參數(shù)曲線Fig.6 Flow feed fermentation process parameters

2.3 延長發(fā)酵周期對對大觀霉素合成的影響

通過2.2流加補料工藝研究發(fā)現(xiàn):流加工藝較好地改善了發(fā)酵后期大觀霉素合成單位增長緩慢的現(xiàn)狀.為進一步提高發(fā)酵水平,將發(fā)酵周期由120 h延長到168 h,并在發(fā)酵96,120,144 h各放料1 次,放料體積為發(fā)酵液運行體積的8%,總產(chǎn)量為4次(放料體積×該發(fā)酵液效價)之和,3批發(fā)酵結(jié)果見表2.

由表2可知:通過延長發(fā)酵周期,平均發(fā)酵單位提高65%,產(chǎn)量提高112%,因144～168 h發(fā)酵單位合成速率開始明顯下降,所以發(fā)酵周期確定為168 h.

表2 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵周期由120 h延長至168 h對大觀霉素合成的影響Table 2 Effect of prolonger fermentation period 120 h to 160 h on synthesis of spectinomycin in 50 L fermentator

2.4 大觀霉素補料新工藝生產(chǎn)罐的應(yīng)用

新工藝在60 t發(fā)酵罐生產(chǎn)線推廣應(yīng)用,發(fā)酵培養(yǎng)基裝量體積40 t,在發(fā)酵周期96,120,144 h各放料1 次,放料體積為發(fā)酵液運行體積的8%,總產(chǎn)量為4次(放料體積×該發(fā)酵液效價)之和,連續(xù)生產(chǎn)5批,結(jié)果如表3.

表3 60 t發(fā)酵罐流加補料工藝對大觀霉素合成的影響Table 3 Effect of flow feeding process in 60 t fermenter on synthesis of spectinomycin

由表3可知:流加補料發(fā)酵工藝在60 t生產(chǎn)線上達到與50 L小試規(guī)模一樣高的發(fā)酵水平和產(chǎn)量,發(fā)酵水平穩(wěn)定,新工藝較原工藝發(fā)酵單位平均提高74%,產(chǎn)量提高111%.

3 結(jié) 論

中國專利[7]報道的一種大觀霉素生產(chǎn)方法,發(fā)酵過程補糖、水,通過NaOH和(NH4)2SO4控制發(fā)酵液pH,最高發(fā)酵單位8 236 U/mL,未見其發(fā)酵放罐體積情況,無法比較發(fā)酵生產(chǎn)指數(shù),其原料蚯蚓粉價格較高采購不易;壯觀鏈霉菌1012生物合成大觀霉素最適溫度為30 ℃,發(fā)酵前期32 ℃培養(yǎng)有利于菌體生長,48 h后30 ℃培養(yǎng)延緩菌絲衰老,利于大觀霉素生物合成;12 h一次間歇補加全料導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧濃度急劇變化,造成生物合成大觀霉素的發(fā)酵環(huán)境劇烈波動;50 L自控發(fā)酵罐流加補料實驗,發(fā)酵過程用質(zhì)量濃度為40%的糊精溶液控制殘?zhí)菨舛?質(zhì)量濃度為15%的硫酸銨溶液控制銨態(tài)氮濃度,工業(yè)氨水控制pH,延長發(fā)酵培養(yǎng)周期至168 h,發(fā)酵過程發(fā)酵液放料3 次,平均發(fā)酵單位提高65%,產(chǎn)量提高112%;流加補料新工藝在60 t發(fā)酵罐放大生產(chǎn),大觀霉素發(fā)酵單位平均提高74%,產(chǎn)量平均提高111%,研究結(jié)果取得較好的經(jīng)濟效益.

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