植物激素對(duì)微擬球藻油脂及二十碳五烯酸積累的影響

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(1.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司,山東 青島 266400;2.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,山東 青島 266101;3.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 青島 266400;4.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局,山東 青島 266400)

二十碳五烯酸(C20∶5,n-3,EPA),是一種ω-3多不飽和脂肪酸,具有重要的生理功能,已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2].由于生物法生產(chǎn)EPA具有培養(yǎng)周期短、不受季節(jié)和來(lái)源限制等特點(diǎn),受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3].微擬球藻是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻,其脂肪酸組成簡(jiǎn)單,富含EPA,已在中國(guó)、日本和澳大利亞等國(guó)家實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模養(yǎng)殖[4].然而,在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下,微擬球藻的生長(zhǎng)緩慢,油脂及EPA的產(chǎn)率較低,因此,提高在大規(guī)模培養(yǎng)中的生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本是本行業(yè)急需克服的關(guān)鍵問題[5-7].除改善培養(yǎng)條件,添加促生長(zhǎng)、促油脂積累的物質(zhì)外,改變微藻培養(yǎng)方式也是可行的方案,目前已有學(xué)者開始嘗試密閉管道式培養(yǎng)與異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)方式[6],一旦有所突破，必將大大提高我國(guó)微擬球藻的產(chǎn)業(yè)化水平.目前微擬球藻已經(jīng)成為工業(yè)化生產(chǎn)EPA的最佳藻株,然而,產(chǎn)量低和成本高仍然是利用微擬球藻大規(guī)模生產(chǎn)EPA的瓶頸.因此提高在大規(guī)模生產(chǎn)中的效率,降低成本,成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-9].植物激素是一類能以極低的濃度來(lái)調(diào)節(jié)植物的生理過程的微量活性物質(zhì),目前已發(fā)現(xiàn)的植物激素主要有細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、赤霉素、乙烯和落葉酸5類,以及水楊酸、茉莉酸類物質(zhì)、油菜素甾醇和多胺等新型植物激素[10].許多植物激素能夠在大規(guī)模的微藻培養(yǎng)中改善高價(jià)值生物制品的積累.劉飛等發(fā)現(xiàn)萘乙酸可以提高小球藻的生長(zhǎng),對(duì)蛋白質(zhì)、單糖、葉綠素a和b、總類胡蘿卜素等必需代謝物的含量有積極的影響[11].楊青等發(fā)現(xiàn)在適宜的濃度條件下,6種植物激素都能不同程度地提高裂壺藻的生長(zhǎng)速度和DHA含量,但是濃度過高會(huì)產(chǎn)生抑制作用[12].

筆者研究了赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤(BA)、糠基腺嘌呤(KT)、細(xì)胞生長(zhǎng)素吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)6種植物激素對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)與EPA產(chǎn)量的影響,并初步探討其提高油脂產(chǎn)量的背后機(jī)理,為利用植物激素提高微擬球藻生產(chǎn)EPA提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)藻種來(lái)源于經(jīng)重離子誘變得到的EPA高產(chǎn)藻株,微擬球藻NannochloropsisoceanicaM44,培養(yǎng)基為BG -11海水培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度25 ℃,光強(qiáng)為150 μmol/(m2·s).

1.2 植物激素的添加

種子在25 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)2 d,然后按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接到搖瓶培養(yǎng)基中,并在搖瓶中添加不同質(zhì)量濃度的植物激素.6種植物激素的添加量為0,1,3,6,10,15,20 mg/L,25 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)8 d.每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,重復(fù)2次.

1.3 細(xì)胞干重、含油率及脂肪酸組成的測(cè)定

1.3.1 細(xì)胞干重測(cè)定

培養(yǎng)物經(jīng)8 000g離心10 min后,棄上清,加入等體積去離子水洗滌1次,-40 ℃真空冷凍干燥48 h,稱其干質(zhì)量.生物量=干質(zhì)量(g)÷培養(yǎng)物體積(L).

1.3.2 脂質(zhì)提取、薄層色譜(TLC)和脂肪酸組成分析

脂質(zhì)提取和脂肪酸甲酯化參照文獻(xiàn)方法并作適當(dāng)改進(jìn)[13].脂質(zhì)提取步驟:首先稱取100 mg的藻粉到2 mL離心管里,加入600 μL 6 mol/L鹽酸,振蕩混勻,室溫放置30 min.沸水煮沸10 min,-80 ℃凍存5 min,此過程重復(fù)2次.加入900 μLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的溶液,漩渦振蕩15 s,12 000 g離心5 min,取下層液相到另一個(gè)2 mL離心管中,加入等體積的飽和NaCl,漩渦振蕩15 s,12 000g離心5 min,將下層液相轉(zhuǎn)移到已經(jīng)稱重好的玻璃小瓶中,50 ℃真空干燥至恒重,稱量.含油率=油脂質(zhì)量(g)÷藻粉質(zhì)量(g)×100%.

薄層色譜(TLC)分析油脂組成變化實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]方法,中性脂展層劑組分為V(正己烷)∶V(乙醚)∶V(乙酸)=70∶30∶1.

脂肪酸甲酯化步驟:稱重完成后,在玻璃小瓶中加入1 mL氯仿和2.5 mLV(硫酸)∶V(甲醇)=1∶50的溶液,并壓蓋,在85 ℃下甲酯化反應(yīng)2.5 h,獲得脂肪酸甲酯(FAME).冷卻后加入1 mL飽和NaCl混勻,加入1 mL正己烷振蕩混勻后靜止分層,吸取上層液相至色譜瓶中.使用裝有HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)的氣相色譜(Agilent Technologies,7890B)進(jìn)行分析[14].柱箱溫度設(shè)定為100 ℃保持1 min,以每分鐘15 ℃的速度升溫至250 ℃,然后在250 ℃下保持5 min.分流比為1∶19,載氣為氮?dú)?進(jìn)樣體積為1 uL.峰值檢測(cè)用火焰離子化檢測(cè)器(FID),檢測(cè)器和進(jìn)樣口的溫度為280 ℃.

1.4 油脂相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步檢測(cè)油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)水平.根據(jù)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物序列(表1).使用試劑盒RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Germany)提取總RNA.使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA.反轉(zhuǎn)錄的體系:5 μg總RNA,1 μL Oligo dT,1 μL 隨機(jī)引物,4 μL 5×buffer,1 μL RiboLock RNase Inhibitor,1 μL Revert Aid Reverse Transcriptase,用RNAase free water補(bǔ)齊20 μL體系.25 ℃,5 min;42 ℃,1 h;70 ℃, 5 min.

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列1)Table 1 The primer sequences of RT-qPCR

注：1) 18 s為18S rDNA;Fas為脂肪酸合酶;Δ5,Δ6,Δ9,Δ12為Δ5,Δ6,Δ9,Δ12去飽和酶;Acc為乙酰輔酶A羧化酶;Dgat為二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶;EL1,EL2為延長(zhǎng)酶1和延長(zhǎng)酶2.

在LightCycler R480實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(Roche)進(jìn)行qPCR反應(yīng).反應(yīng)體系:10 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),1 μL qRT-PCR正向引物,1 μL qRT-PCR反向引物,9 μL 50×cDNA.在LightCycler R480實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(Roche)中進(jìn)行qPCR,并用擴(kuò)增產(chǎn)物的融合曲線分析以確認(rèn)擴(kuò)增的特異性.最后以18S rRNA作為內(nèi)參,使用CT方法(2-ΔΔCT)分析計(jì)算基因表達(dá)差異.所有反應(yīng)一式三份,數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)平均值標(biāo)準(zhǔn)化.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 植物激素對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)及油脂合成的影響

不同質(zhì)量濃度的6種植物激素對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)及油脂積累的影響,如圖1所示.在適宜的質(zhì)量濃度條件下,6種植物激素均能促進(jìn)微擬球藻的生長(zhǎng),在不同程度上提高微擬球藻的生物量以及油脂和EPA的產(chǎn)量,而在質(zhì)量濃度過高時(shí)抑制微擬球藻生長(zhǎng),這符合植物激素在低濃度時(shí)促進(jìn)生長(zhǎng)、高濃度時(shí)抑制生長(zhǎng)的規(guī)律.表2中詳細(xì)說(shuō)明了每種植物激素在最佳質(zhì)量濃度下對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)以及油脂和EPA積累的促進(jìn)效果,其中添加20 mg/L IBA時(shí)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多提高20.94%,其次是質(zhì)量濃度為15 mg/L的BA,油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了20.27%.同時(shí),當(dāng)BA在質(zhì)量濃度為15 mg/L時(shí),EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多提高29.50%.綜合兩項(xiàng)指標(biāo),6-芐基腺嘌呤(BA)對(duì)微擬球藻的生長(zhǎng)以及油脂和EPA的產(chǎn)量影響最大,最佳添加量為15 mg/L.而脫落酸(ABA)效果最差,油脂和EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)只分別提高了8.14%和3.78%.

表2最佳質(zhì)量濃度下植物激素對(duì)微擬球藻油脂和EPA產(chǎn)量的影響

Table2TheeffectsofplanthormonesonthelipidandEPAyieldofNannochloropsisoceanicaM44undertheoptimumconcentration

植物激素名稱最佳添加量/(mg·L-1)油脂產(chǎn)量提高百分比/%EPA產(chǎn)量提高百分比/%KT118.0620.52BA1520.2729.50GA315.2919.79ABA158.143.78IAA1019.4222.05IBA2020.9413.87

圖1 不同植物激素對(duì)微擬球藻生長(zhǎng)以及油脂和EPA產(chǎn)量的影響Fig.1 The effects of different plant hormones on the growth, lipid and EPA yield of Nannochloropsis oceanica M44

2.2 植物激素對(duì)微擬球藻油脂及脂肪酸組成的影響

利用薄層色譜分析6種激素對(duì)微擬球藻油脂組成的影響發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,添加植物激素后油脂組成沒有發(fā)生顯著變化,都是以甘油三酯(TAG)為主要的油脂儲(chǔ)存形式,但從圖2中看出:添加植物激素后TAG的量明顯高于對(duì)照組.

從表3中看出:添加植物激素后微擬球藻脂肪酸的組成并沒有發(fā)生變化.脂肪酸合成途徑中積累比較多的仍是棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)和二十碳五烯酸(C20∶5,EPA).EPA的含量占總脂肪酸的40%以上.

Lane 1,5—對(duì)照組;Lane 2～4,6～8—KT1,BA15,GA3,ABA15,IAA10,IBA20圖2 薄層色譜分析6種激素對(duì)微擬球藻油脂組成的影響Fig.2 TLC analysis of the effects of plant hormones on the lipid composition of Nannochloropsis oceanica M44

脂肪酸總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%CKKT1BA15GA3ABA15IAA10IBA20C14∶08.34±0.117.24±0.175.01±0.085.84±0.115.18±0.085.22±0.125.05±0.09C16∶018.34±0.1519.16±0.4117.07±0.2718.85±0.2817.63±0.0717.40±0.6116.80±0.85C16∶1Δ99.61±0.119.25±0.1510.28±0.099.77±0.2310.34±0.479.78±0.1810.79±0.69C18∶04.51±0.284.90±0.324.68±0.104.99±0.386.38±0.155.47±0.496.29±0.14C18∶1Δ98.18±0.177.79±0.038.74±0.217.78±0.399.53±0.258.18±0.5511.17±1.13C18∶2Δ9,123.40±0.103.57±0.153.74±0.013.75±0.213.65±0.043.67±0.053.43±0.08C20∶4Δ5,8,11,143.11±0.032.92±0.362.88±0.292.92±0.133.01±0.012.97±0.033.12±0.05C20∶5Δ5,8,11,14,17(EPA)44.25±0.3845.17±0.2247.52±0.1945.97±0.1444.05±1.4446.91±0.3743.22±0.64

2.3 植物激素對(duì)微擬球藻油脂合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了闡明植物激素促進(jìn)微擬球藻油脂及EPA產(chǎn)量增加的分子機(jī)制,筆者選取了脂肪酸及油脂合成過程中起重要作用的各個(gè)關(guān)鍵酶[15]:乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(Fas)、脂肪酸延長(zhǎng)酶1(EL1)和延長(zhǎng)酶2(EL2)、脂肪酸去飽和酶(Δ5,Δ6,Δ9,Δ12去飽和酶)以及二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT),研究添加不同植物激素(選取對(duì)油脂合成影響最顯著的糠基腺嘌呤(KT),6-芐基腺嘌呤(BA),吲哚乙酸(IAA))后,它們各自轉(zhuǎn)錄水平的變化.通過定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)(圖3):從轉(zhuǎn)錄水平上看,添加BA時(shí)各基因轉(zhuǎn)錄水平變化最大,其中Δ9去飽和酶、FAS和DGAT轉(zhuǎn)錄水平分別提高了9.3,9.6,7.7倍,其次為IAA,Δ9去飽和酶、FAS和DGAT轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.1,8.9,2.7倍.這說(shuō)明BA和IAA對(duì)微擬球藻油脂合成的影響是一致的,兩者都通過影響Fas的轉(zhuǎn)錄水平提高了軟脂酸C16∶0的合成,再通過影響去飽和酶及DGAT的轉(zhuǎn)錄水平增加了TAG的合成.

CK—對(duì)照組;KT1—1 mg/L糠基腺嘌呤;BA15—15 mg/L6-芐基腺嘌呤;IAA10—10 mg/L吲哚乙酸 圖3 3種植物激素對(duì)微擬球藻油脂合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 Fig.3 The effects of plant horones on the gene transcriptions of lipid synthesis in Nannochloropsis oculata M44

而KT對(duì)微擬球藻油脂合成的影響與BA和IAA不同,主要通過增強(qiáng)脂肪酸延長(zhǎng)及去飽和途徑關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)實(shí)現(xiàn)增加油脂產(chǎn)量的目的,表現(xiàn)為延長(zhǎng)酶2、Δ9去飽和酶、Fas的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.7,4.0,2.4倍.

3 結(jié) 論

植物激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控一般通過調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、胞內(nèi)代謝和環(huán)境脅迫響應(yīng)機(jī)制等方式實(shí)現(xiàn)[16-17].不同的激素有可能通過調(diào)控相同的下游基因的表達(dá)來(lái)控制相同生理過程[18].本研究證實(shí)植物激素對(duì)微擬球藻的影響主要是集中在對(duì)微擬球藻油脂合成途徑的改變上,BA和IAA通過影響Fas的轉(zhuǎn)錄水平提高了脂肪酸合成的總量,增加了油脂合成的底物供應(yīng),再通過增加DGAT的轉(zhuǎn)錄水平,促進(jìn)了甘油三酯的合成,增加了細(xì)胞中油脂的產(chǎn)量.而KT對(duì)油脂合成的影響與BA和IAA不同,主要是影響脂肪酸延長(zhǎng)及去飽和途徑的活力,通過增加軟脂酸向下游脂肪酸的持續(xù)轉(zhuǎn)化來(lái)推動(dòng)油脂的合成過程.

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