多層試驗(yàn)組合策略對(duì)1,2-己二醇眼刺激性/腐蝕性的評(píng)價(jià)

陳秀娟, 黃宇鋒, 劉香梅, 龐增雄, 江 漪, 李培寧, 李光先, 陳梓靈, 孫 俠, 王 強(qiáng)

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院, 廣州 511447)

1,2-己二醇(1,2-Hexanediol )是一種多元醇，無(wú)色無(wú)味, 主要用于化妝品制造、醫(yī)藥制造、食品加工、噴墨制造等行業(yè)[1]。1,2-己二醇是一種具有很寬的抗菌廣譜性和高活性的原料，目前化妝品制造商正在研究用1,2-己二醇替代苯甲酸類、甲醛類供體和苯氧乙醇類用于化妝品的防腐控制[2,3]。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)視防腐劑為限用物質(zhì)，并對(duì)防腐劑的種類及使用量作了嚴(yán)格的規(guī)定[4], 但1,2-己二醇并未被列入防腐劑的范疇, 也未對(duì)其作出安全使用量的說明。因此有必要對(duì)1,2-己二醇的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià), 為1,2-己二醇在化妝品中的使用提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)。近年來基于動(dòng)物福利及科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步, 多種替代動(dòng)物試驗(yàn)的體外方法得到開發(fā)和應(yīng)用[5]。其中牛眼角膜混濁/滲透性試驗(yàn)(bovine corneal opacity and permeability, BCOP)和雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)(hen’s egg test - chorioallantoic membrane,HET-CAM) 是目前國(guó)內(nèi)外比較常用的眼刺激性/腐蝕性的體外替代方法。由于每一個(gè)替代方法均有其局限性，因此通常采用組合策略, 以實(shí)現(xiàn)減少動(dòng)物試驗(yàn)或完全覆蓋動(dòng)物試驗(yàn)所顯示的刺激性范圍[5]。本文采用自下而上的組合策略，在符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則基礎(chǔ)上對(duì)1,2-己二醇是否引起眼刺激性/腐蝕性反應(yīng)進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 受試物

1,2-己二醇為無(wú)色無(wú)味透明液體，由廣州廣曼生物科技有限公司提供，批號(hào)為BNB-C301017，純度為99.87%。使用前用滅菌生理鹽水稀釋至相應(yīng)的濃度。陰性對(duì)照物采用生理鹽水質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.9%NaCl, NS), 陽(yáng)性對(duì)照物采用無(wú)水乙醇及NaOH溶液(0.1 mol/L)。生理鹽水購(gòu)自廣東科倫藥業(yè)有限公司; 無(wú)水乙醇購(gòu)自廣州市中南化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)150831，純度為分析純; NaOH購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20150401-1，純度為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

SPF級(jí)雞胚由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2014-0002]; 離體牛眼角膜由華代生物科技有限公司提供; 新西蘭兔由廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供[SCXK(粵)2014-0023]。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(粵)2014-0137]。MEM培養(yǎng)基、Hanks平衡鹽溶液均由美國(guó)Life Technologies Corporation 公司提供。

1.3 主要儀器

德國(guó)BASF公司 Opacitometer Kit3.0型混濁度測(cè)量?jī)x; 美國(guó)伯樂公司iMARK型酶標(biāo)儀; 上海一恒科學(xué)儀器有限公司LRH250F型生化培養(yǎng)箱; 德國(guó)蔡司公司Stemi-2000C型體視顯微鏡。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 自下而上的分層測(cè)試組合策略 對(duì)不同濃度的1,2-己二醇進(jìn)行測(cè)試，即用HET-CAM試驗(yàn)，鑒別受試物是否為“無(wú)刺激性”或“刺激性”; 如結(jié)果為“無(wú)刺激性”，則無(wú)需另外測(cè)試，如結(jié)果為“刺激性”，再進(jìn)行BCO P試驗(yàn)，區(qū)分“無(wú)刺激性”或“刺激性”的濃度范圍；依據(jù)BCOP試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)“刺激性”的濃度進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，最終確認(rèn)1,2-己二醇無(wú)眼刺激性的最高濃度(試驗(yàn)流程見圖1)。

圖1 多層試驗(yàn)組合策略

1.4.2 HET-CAM試驗(yàn) 按進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2329-2009進(jìn)行操作[6], 用照蛋器選取受精正常且有活力的9日齡雞胚, 去除氣室部位蛋殼，加1～2 mL生理鹽水溶液濕潤(rùn)蛋膜，把多余的液體傾出后去除內(nèi)膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜(CAM)，通過觀察血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的完整性選擇合適的雞胚用于實(shí)驗(yàn)。分別取0.3 mL各濃度的受試物滴加于CAM表面，采用時(shí)間評(píng)價(jià)法(連續(xù)模式評(píng)分) ，即觀察5 min 內(nèi)CAM 血管變化并記錄CAM 血管充血、出血和凝血出現(xiàn)的初始時(shí)間(s)，根據(jù)觀察結(jié)果，計(jì)算刺激分值(irritation score，IS)(見公式1)。根據(jù)進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2329-2009對(duì)HET-CAM實(shí)驗(yàn)結(jié)果按眼刺激時(shí)間評(píng)價(jià)法的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(表1)。

式中: secH 出血時(shí)間(s); secL 血管融解時(shí)間(s);secC凝血時(shí)間(s)

表1 HET-CAM試驗(yàn)IS眼刺激時(shí)間評(píng)價(jià)法的分類標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 離體組織型的BCOP試驗(yàn) 參考亞太經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD) 測(cè)試指南437進(jìn)行操作[8]，分離角膜，用Hanks鹽溶液清洗3遍，將角膜固定于角膜挾持器中，加入含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的MEM無(wú)酚紅培養(yǎng)液填滿后室和前室，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，更換新的培養(yǎng)液，用濁度儀測(cè)量角膜濁度本底值，選擇合適的角膜用于實(shí)驗(yàn)。移除前室中的無(wú)酚紅MEM培養(yǎng)液, 加入750 μL各濃度的受試物, 暴露染毒10 min。染毒結(jié)束后,進(jìn)行清洗程序, 清洗后用無(wú)酚紅的MEM培養(yǎng)液充滿前房。置32 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后更換無(wú)酚紅MEM培養(yǎng)液。測(cè)量角膜濁度值。測(cè)量完畢后前室的無(wú)酚紅MEM培養(yǎng)液更換為1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%熒光素鈉溶液，繼續(xù)培養(yǎng)90 min, 收集后室全部液體, 混勻后用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量角膜吸光度(A)值。計(jì)算體外刺激評(píng)分值(in vitroirritancy score，IVIS) (公式2)。根據(jù)OECD 437指南和聯(lián)合國(guó)全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)識(shí)制度(UN GHS)，對(duì)BCOP 眼刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行UN GHS分類(表2)。

表2 BCOP試驗(yàn)IVIS 值與刺激性UN GHS 分類標(biāo)準(zhǔn)

1.4.4 兔眼刺激試驗(yàn)(Draize試驗(yàn)) 依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)進(jìn)行[4]。給予不同濃度的1,2-己二醇后, 于給藥后30 s用生理鹽水進(jìn)行沖洗, 觀察兔角膜、虹膜和結(jié)膜各自在24 h、48 h和72 h的刺激反應(yīng), 根據(jù)刺激反應(yīng)積分的均值和恢復(fù)時(shí)間評(píng)價(jià), 按規(guī)范所述的分級(jí)判定其眼刺激性的強(qiáng)度。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，用單因素方差分析(ANVOA)進(jìn)行q檢驗(yàn)。組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CAM與體積分?jǐn)?shù)0.312%～10.00%的1,2-己二醇接觸后，在體視顯微鏡下均觀察到出現(xiàn)不同程度的充血、出血和凝血，IS積分隨著1,2-己二醇濃度的增加呈上升趨勢(shì)，詳見表3。

2.1 HET-CAM試驗(yàn)

表3 不同濃度的1,2-己二醇HET-CAM試驗(yàn)

2.2 BCOP試驗(yàn)

依據(jù)HET-CAM試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)有刺激性的體積分?jǐn)?shù)1.25%～10.00%1,2-己二醇進(jìn)行BCOP試驗(yàn)。不同濃度的1,2-己二醇與離體牛眼角膜接觸10 min，牛角膜混濁度和熒光素納滲透性均發(fā)生不同程度的改變。IVIS分值隨著1,2-己二醇濃度的增加而增加，表明1,2-己二醇對(duì)眼刺激性/腐蝕性程度有增強(qiáng)的趨勢(shì), 體積分?jǐn)?shù)10.00%時(shí)有嚴(yán)重腐蝕性(表4)。

2.3 Draize試驗(yàn)

根據(jù)IVIS分值, 對(duì)有刺激性的體積分?jǐn)?shù)2.50%～10.00% 的1,2-己二醇進(jìn)行Draize試驗(yàn)，結(jié)果體積分?jǐn)?shù)2.50%～5.00%的1,2-己二醇為無(wú)刺激性，體積分?jǐn)?shù)10.00%的1,2-己二醇對(duì)3只兔的結(jié)膜和角膜均造成不同程度的損傷，給藥后6 d恢復(fù)正常，有輕刺激性(表5)。

3 討論

正常情況下眼睛很少直接接觸外源性化學(xué)物，但在化妝品使用過程中，通常由于意外而使化妝品(例如潔面乳、眼部彩妝品等)以稀釋的形式進(jìn)入眼睛產(chǎn)生刺激作用。目前我國(guó)的化妝品、農(nóng)藥、消毒產(chǎn)品、化學(xué)品等安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用傳統(tǒng)的兔眼實(shí)驗(yàn)，是由Draize等[8]于1944年建立的，一直被認(rèn)為是評(píng)價(jià)眼刺激性的金標(biāo)準(zhǔn)。但近年來，在動(dòng)物福利的壓力下，國(guó)內(nèi)外的專家學(xué)者正嘗試建立代替?zhèn)鹘y(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體外方法，一些優(yōu)化的眼刺激性體外試驗(yàn)方法陸續(xù)被驗(yàn)證和認(rèn)可。BCOP、HET-CAM是分別被OECD和歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)認(rèn)可、驗(yàn)證的方法，國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究也已證實(shí)BCOP、HET-CAM可用于化妝品、消毒產(chǎn)品等眼刺激性的分類[9-11]。但到目前為止，還沒有體外試驗(yàn)可以完全替代Draize試驗(yàn)，體外試驗(yàn)的預(yù)測(cè)范圍也沒有完全覆蓋Draize試驗(yàn)所反映的損傷和炎癥的標(biāo)準(zhǔn)范圍。從本文各項(xiàng)體外替代試驗(yàn)可見，在BCOP試驗(yàn)中體積分?jǐn)?shù)10.00%的1,2-己二醇有“嚴(yán)重腐蝕性”，而在動(dòng)物試驗(yàn)僅顯示為“輕刺激性”。BCOP只評(píng)估了角膜損傷，因而適于區(qū)分到重度眼刺激性物質(zhì)，對(duì)于輕刺激和刺激性物質(zhì)區(qū)分不夠敏感[12]。HET-CAM結(jié)構(gòu)與眼結(jié)膜相似，通過觀察受試物對(duì)HET-CAM血管的作用評(píng)價(jià)受試物的眼刺激性，敖華英等[13]證實(shí)該法對(duì)于檢測(cè)中度以下的眼刺激性效果較好，能有效區(qū)分無(wú)刺激性物質(zhì)。但HET-CAM試驗(yàn)只模擬了Draize兔試驗(yàn)的結(jié)膜反應(yīng)，未考慮刺激反應(yīng)的可逆性。鑒于此，考慮到BCOP和HET-CAM試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方面具有一定的局限性，為了能在安全的前提下合理利用1,2-己二醇作為防腐體系，本研究在體外試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用少量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最終確認(rèn)1,2-己二醇最高無(wú)眼刺激性濃度為體積分?jǐn)?shù)5.00%。

表4 不同濃度的1,2-己二醇暴露10 min后BCOP實(shí)驗(yàn)

表5 不同濃度的1,2-己二醇Draize試驗(yàn)

[1]李文. 高純度1,2-己二醇的合成研究[J]. 研究前沿, 2008,22(16):24-25.

[2]龔盛昭. 一種具有防腐功效的組合物及在化妝品中的應(yīng)用[P]. 中國(guó)專利號(hào): CN103494713B, 2015-05-06.

[3]姜炫守. 一種化妝品添加劑及化妝品[P].中國(guó)專利號(hào):CN102379821A,2012-03-21.

[4]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局. 化妝品衛(wèi)生規(guī)范[M]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2015:113-118.

[5]程樹軍, 焦紅. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法原理與應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010:285-304.

[6]國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì), 中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).SN/T 2329-2009化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版, 2009.

[7]OECD. OECD Guidelines for testing of chemicals, 437: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii)Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage[S]. Paris:2013.

[8]Draize J, Woodard G, Calvery H. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1944,82:377-390.

[9]黃健聰, 秦瑤, 程樹軍, 等. 牛角膜渾濁滲透試驗(yàn)方法預(yù)測(cè)眼刺激性的研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2014, 24(14):1980-1983.

[10]楊美玲, 黃俊明, 譚小華, 等. 雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)應(yīng)用于抗菌洗液類產(chǎn)品毒性初篩研究[J]. 華南預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012,38(5):66-68.

[11]邱璐, 李小林, 卞俐娜, 等. 雞胚尿囊膜(HET-CAM) 眼刺激替代試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)品及原料評(píng)價(jià)的比較[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 21(3):27-30.

[12]Casey W, Jacobs A, Maull E, et al. A new path forward: the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and National Toxicology Program's Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM)[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2015, 54(2):170-173.

[13]敖華英, 程樹軍, 潘芳, 等. 化妝品眼刺激試驗(yàn)替代方法標(biāo)準(zhǔn)化與展望[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 22(1):74-78.