恩度聯(lián)合順鉑治療惡性腹腔積液的療效及安全性評估

嚴(yán) 俊, 盧國豐, 王 純, 閔 新

(上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院1. 腫瘤科; 2. 病理科, 上海201800)

惡性腹水是腫瘤細(xì)胞浸潤或分泌引起的腹腔內(nèi)非正常的液體累積，是多種惡性腫瘤發(fā)展晚期的常見并發(fā)癥之一。研究報(bào)道[1,2]惡性腹水可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其平均生存期約為20周。目前，惡性腹水的治療方法包括穿刺療法、利尿劑療法及腹腔分流術(shù)。其中腹腔分流術(shù)及腹腔注射化療藥物的方法較為常見。然而，腹腔注射化療藥物治療腹水的有效率僅40%～60%，可能與腫瘤細(xì)胞化療藥物抵抗性或血管生成密切相關(guān)。因此，緩解腫瘤患者惡性腹水是目前臨床亟待解決問題。

腹膜毛細(xì)血管通透性增加是產(chǎn)生惡性腹水的重要原因之一; 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)對于刺激血管生成，增加血管通透性起到重要作用[2]。因此，抗VEGF治療可能是治療惡性腹水的理想方式之一。內(nèi)皮抑素(endostatin)是VEGF的有效抑制劑。早期內(nèi)皮抑素由O'Reilly[3]從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中分離得到，是膠原蛋白XVIII的羧基末端蛋白水解片段。內(nèi)皮抑素可顯著抑制VEGF引起的上皮細(xì)胞增生及抑制血管生成和腫瘤生長[4]。然而, 膠原蛋白XVIII穩(wěn)定性較差，生化活性較低，且造價(jià)昂貴，在臨床應(yīng)用受到了極大限制。恩度(Endostar)是大腸桿菌中表達(dá)和純化的改良性內(nèi)皮抑素[5]。與內(nèi)皮抑素相比，恩度在N端增加了9個(gè)氨基酸序列，從而提高了穩(wěn)定性和生物活性。并且恩度通過大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn), 可顯著降低生產(chǎn)成本。在2005年恩度被中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的治療[6]。恩度在治療各種晚期惡性腫瘤方面取得了臨床療效[7,8]。

順鉑(Cisplatin, CDDP)是一種含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑(II)，棕黃色粉末，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物。順鉑主要通過與腫瘤細(xì)胞DNA單鏈內(nèi)兩點(diǎn)或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制癌細(xì)胞DNA復(fù)制過程，殺傷腫瘤細(xì)胞。目前在對腹水治療方面，順鉑廣泛用于腹腔熱灌注化療，該方法可將有效濃度順鉑持續(xù)分布到腹腔的各個(gè)部位，有利于抗癌藥物與游離癌細(xì)胞充分接觸; 但其療效還依賴于腫瘤的體積大小以及腫瘤類型[9]。

目前，關(guān)于恩度聯(lián)合順鉑治療惡性腹水的有效性證據(jù)仍較為有限，本研究擬確定恩度新型適應(yīng)癥，為其用于治療惡性腹水相關(guān)的晚期癌癥提供理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選取肝癌細(xì)胞系H-22(購自中科院上海科學(xué)研究所細(xì)胞庫)體外培養(yǎng)。將H-22細(xì)胞復(fù)蘇，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(購自美國Thermol-Fisher公司)的RPMI1640培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)待用。

1.2 惡性腹水動(dòng)物模型建立

試驗(yàn)選用100只6～7周齡雌性BALB/c小鼠[(購于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司, SCXK(滬)2013-0016)]。飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(滬)2017-0011], 自由飲水, 給予滅菌小大鼠專用飼料。將處于對數(shù)生長期的H-22細(xì)胞制成混懸液，腹腔注射給予入8只BALB/c小鼠(3×105個(gè)細(xì)胞/200 μL)體內(nèi)。待小鼠體內(nèi)腹水較多時(shí)以頸椎脫臼法處死動(dòng)物, 抽取腹水,臺酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL, 每只小鼠腹腔注射200 μL備用細(xì)胞, 共接種90只動(dòng)物。

1.3 分組及動(dòng)物處理

將構(gòu)建成功的荷瘤鼠隨機(jī)分為5組, 每組18只,腹腔注射給藥容量為0.2 mL，給藥期間隔日測量腹圍及體質(zhì)量。給藥用恩度(重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液)購自山東煙臺先聲麥得津生物工程股份有限公司，順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字: H20040B13)。所用恩度及順鉑用藥劑量參考產(chǎn)品說明書。具體分組見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

1.4 腹水體積、蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)量、腫瘤細(xì)胞檢測

實(shí)驗(yàn)期間，隔日稱取動(dòng)物體質(zhì)量，治療結(jié)束后，每組取6只小鼠，用無菌離心管采集腹水樣品，并進(jìn)行蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)量、腫瘤細(xì)胞的檢測，其余動(dòng)物觀察各組荷瘤壽命，以對照組全部死亡為實(shí)驗(yàn)結(jié)束的節(jié)點(diǎn)。蛋白濃度檢測使用全自動(dòng)生化檢測儀進(jìn)行檢測。

1.5 腹水瘤細(xì)胞中VEGF、Bax，Bcl-2和HIF-1a水平檢測

轉(zhuǎn)膜后，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在5%BSA中封閉1h，加入適量一抗孵育過夜，之后用PBST洗膜3次，與適量二抗孵育1h，充分洗膜后加入顯影液，使用曝光機(jī)進(jìn)行拍攝。

Western blotting采用Quantity One分析軟件，用矩形選擇工具框選目的條帶, 計(jì)算灰度值, 用條帶框的值減去等大的背景框灰度，得到條帶的灰度值。分別用各實(shí)驗(yàn)組的數(shù)值比照未經(jīng)任何處理的空白小鼠相應(yīng)條帶灰度值，得到標(biāo)準(zhǔn)化的條帶濃度。

1.6 腹水瘤細(xì)胞中VEGF mRNA水平檢測

1.6.1 引物合成 采用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程公司合成。引物名稱、擴(kuò)增靶基因號及對應(yīng)引物序列見表2。

1.6.2 RNA提取 采用RNA提取試劑盒(購自北京TIANGEN生化，dp419)進(jìn)行提取。

1.6.3 反應(yīng)體系 采用20 μL反應(yīng)體系: 2×Real time PCR Master Mix 10 μL, 模板 1 μL，引物 MIX 2 μL，DEPC 水 7 μL。

1.6.4 PCR 過程 95℃ 5 min→ 95 ℃ 15 s → 60℃30 s → 72℃ 30 s → 45 ℃→ 95℃, 40 個(gè)循環(huán)。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.6.5 定量方法 以β-actin作為內(nèi)參，各樣本中VEGFmRNA的ct值與同一樣本中的β-actinRNA ct值相減。采用相對定量法，以2-△△Ct公式計(jì)算各樣本中的VEGFmRNA表達(dá)量。

(1) 坡體地質(zhì)條件。項(xiàng)目區(qū)屬構(gòu)造剝蝕高山峽谷的上緩下陡形臺階狀地貌，自然邊坡高約400 m，其上部較緩邊坡坡度約40°，下部陡崖坡度約70°～80°，崖頂與坡腳高差約190 m，坡向50°，線路以大橋的形式從坡腳通過，橋面高出河道約6 m。坡體主要由志留系茂縣群(Smx4)絹云母千枚巖和夾少量條帶—薄層狀變質(zhì)細(xì)砂巖構(gòu)成。由于坡體位于桃坪倒轉(zhuǎn)背斜核部，造成坡體褶皺、擠壓破碎帶發(fā)育。邊坡優(yōu)勢產(chǎn)狀345°∠77°，屬陡傾斜交結(jié)構(gòu)邊坡。項(xiàng)目區(qū)地震動(dòng)峰值加速度0.20 g，地震基本烈度Ⅷ度。下半球赤平投影見圖9，工程地質(zhì)斷面圖見圖10。

1.7 荷瘤小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞凋亡檢測

收集各組小鼠腹水約5 mL，加入紅細(xì)胞裂解液，孵育10 min后2 000 r/min離心5 min，收集腫瘤細(xì)胞，并用PBS洗滌2次。加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC及Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 小鼠生存期觀察

記錄每只小鼠生存時(shí)間，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并按下列公式計(jì)算小鼠生命延長率: 生命延長率=(治療組平均生存時(shí)間/對照組平均生存時(shí)間-1)×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。連續(xù)變量采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用One-way ANOVA，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用藥物相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)來反映兩藥聯(lián)合抑制腹水的作用。根據(jù)以下公式計(jì)算各組小鼠腹水抑制率及CDI，兩藥聯(lián)用CDI值＜1，說明恩度及順鉑具有協(xié)同作用。腹水抑制率=(1-給藥組平均腹水量/生理鹽水組平均腹水量)×100%;CDI=恩度順鉑聯(lián)合給藥腹水抑制率/(單獨(dú)恩度組腹水抑制率×單獨(dú)順鉑組腹水抑制率)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及腹圍分析

給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化曲線見圖1。重復(fù)測量ANOVA分析顯示, 各實(shí)驗(yàn)組給藥期間體質(zhì)量增長速度均顯著低于生理鹽水組(P=0.012)，其中恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠體質(zhì)量增長速度顯著低于單純恩度組(P=0.006)、單純順鉑組(P=0.019)和恩度聯(lián)合順鉑組2(P=0.004)。給藥期間各組小鼠腹圍變化曲線見圖2。重復(fù)測量ANOVA分析顯示，各實(shí)驗(yàn)組給藥期間腹圍增長速度均顯著低于生理鹽水組(P=0.001), 其中恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠腹圍增長速度顯著低于單純恩度組(P＜0.001)、單純順鉑組(P=0.034)小鼠和恩度聯(lián)合順鉑組2(P＜0.001)。

2.2 小鼠平均腹水量及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

各組小鼠腹水量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A，P＜0.01), 兩兩分析顯示, 生理鹽水組小鼠腹水量顯著高于單純恩度組(P=0.02)、單純順鉑組(P＜0.01)、恩度順鉑聯(lián)合組1(P＜0.01)和恩度順鉑聯(lián)合組2(P=0.01);恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠腹水量顯著低于單純恩度組(P＜0.01)、單純順鉑組(P＜0.01)和恩度聯(lián)合順鉑組2(P=0.02)。各組小鼠腹水中紅細(xì)胞數(shù)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B,P＜0.01)，兩兩分析顯示，生理鹽水組小鼠腹水中紅細(xì)胞量顯著高于各實(shí)驗(yàn)組(均P＜0.01); 恩度聯(lián)合順鉑組1小鼠腹水中紅細(xì)胞含量顯著低于單純恩度組(P＜0.01)和單純順鉑組(P＜0.01)。

圖1 給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化曲線

圖2 給藥期間各組小鼠腹圍變化曲線

2.3 各組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量及凋亡情況

圖3 各組小鼠腹水量及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

各組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4A，P＜0.01), 兩兩分析顯示, 生理鹽水組鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著高于單純恩度組(P=0.01)、單純順鉑組(P＜0.01)、恩度順鉑聯(lián)合組1(P＜0.01)和恩度順鉑聯(lián)合組(P=0.01)，單純順鉑組腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量與恩度順鉑聯(lián)合組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B,P＜0.01)，兩兩分析顯示，生理鹽水組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著低于順鉑、恩度順鉑聯(lián)合組1和恩度順鉑聯(lián)合組2(均P＜0.01)，但與單純恩度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組小鼠腫瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

各實(shí)驗(yàn)組腹水腫瘤細(xì)胞Bcl-2及HIF1α表達(dá)量均低于生理鹽水組，Bax表達(dá)量均高于生理鹽水組。單純恩度組Bcl-2及HIF1α表達(dá)量變化低于單獨(dú)順鉑組和聯(lián)用順鉑各組(圖5)。

2.5 各組小鼠腫瘤細(xì)胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA水平

細(xì)胞中VEGF水平，PCR方法檢測各組小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中VEGFmRNA水平，結(jié)果顯示，單純恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組1和恩度聯(lián)合順鉑組2小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)量和VEGFmRNA水平均顯著低于生理鹽水組及單純順鉑組，單純順鉑組VEGF蛋白表達(dá)量和VEGFmRNA水平顯著低于生理鹽水組。

2.6 小鼠平均生存時(shí)間

對各組小鼠生存時(shí)間進(jìn)行分析，Logrank分析顯示恩度聯(lián)合順鉑對于小鼠的生存時(shí)間有顯著延長作用(P＜0.001，圖7)。

2.7 順鉑及恩度聯(lián)合作用

根據(jù)以下公式計(jì)算各組小鼠腹水抑制率及CDI，結(jié)果見表3。兩藥聯(lián)用CDI值＜1，說明恩度及順鉑具有協(xié)同作用。

圖4 各組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)及腫瘤細(xì)胞凋亡情況

圖5 各組小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中Bcl-2、Bax及HIF1α水平

圖6 各組小鼠腹水腫瘤細(xì)胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA水平比較

圖7 各組小鼠生曲線

3 討論

研究表明，惡性患者的胸腔積液和腹水中可檢測到高濃度VEGF[10,11]，腫瘤細(xì)胞所釋放的VEGF可造成血管大量生成、血管通透性增加[12,13]。同時(shí)，由于腹水中含有大量腫瘤細(xì)胞，腹水滲漏也有可能造成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，減少惡性腹水生成并減少腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量是治療惡性腹水重點(diǎn)。據(jù)報(bào)道[6-9]恩度對于惡性腹水有明顯的抑制作用，而對于腹水中腫瘤細(xì)胞殺傷作用較為溫和; 順鉑可與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，顯著殺傷腫瘤細(xì)胞。為此，本研究采用順鉑與恩度聯(lián)合用藥，旨在研究恩度聯(lián)合順鉑是否可以影響惡性腹水的生成、減少腹水中腫瘤細(xì)胞并延長生存期。

表3 各組腹水抑制率及CDI值

本試驗(yàn)采用小鼠為模型。結(jié)果顯示，恩度和順鉑單獨(dú)使用均可減少小鼠產(chǎn)生的腹水體積，同時(shí)降低腹水中腫瘤細(xì)胞和RBC的數(shù)量，延長注射恩度小鼠的生存時(shí)間，而兩者聯(lián)用效果更好。同時(shí)，先前研究[14]也表明恩度僅能抑制腹水的形成，不能抑制腫瘤的生長。本研究中單獨(dú)使用恩度，不能造成腫瘤凋亡，然而單獨(dú)使用順鉑或者聯(lián)合使用順鉑和恩度，可以顯著增加腹水中腫瘤細(xì)胞的凋亡率。此外，單獨(dú)使用恩度或順鉑組小鼠腹水量及腹水中紅細(xì)胞比例明顯低于對照組小鼠。這說明恩度和順鉑可以有效減少紅細(xì)胞滲漏入腹水; 同時(shí)，聯(lián)用恩度及順鉑組小鼠腹水量、腹水中紅細(xì)胞比例及生存期均顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥組小鼠，說明恩度和順鉑聯(lián)用可有效抑制腹水產(chǎn)生，減少腹水中紅細(xì)胞滲透率，延長動(dòng)物生存期。

已有研究表明，內(nèi)皮抑制素的作用與VEGF有關(guān)，VEGF是血管生成的重要調(diào)節(jié)劑[15]，而恩度正是通過與內(nèi)皮抑制素相似的機(jī)制產(chǎn)生抗血管生成的效應(yīng)。與內(nèi)皮抑制素不同，恩度增加了9種氨基酸，從而可以有效提高蛋白質(zhì)的半衰期，并與鋅結(jié)合[16]。當(dāng)被蛋白水解作用激活時(shí)，內(nèi)皮抑制素可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化及促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗血管生成活性。也有研究證明，內(nèi)皮抑制素可通過與腫瘤細(xì)胞表面受體(如整合素受體)結(jié)合來起到直接的抗腫瘤作用。體外數(shù)據(jù)顯示，內(nèi)皮抑素抑制癌細(xì)胞生長和遷移，阻止G1期癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。此外，它是一種廣譜和低毒多靶點(diǎn)血管生成抑制劑，可抑制多達(dá)65種類型的腫瘤[17]，在治療各種晚期惡性腫瘤方面取得了臨床療效[6,7]。臨床證據(jù)顯示，恩度結(jié)合化療藥物，可在抑制腫瘤發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。此外，在廣泛非小細(xì)胞肺癌的患者中聯(lián)合使用恩度和鉑類化療藥物，不會增加鉑類化療藥物的毒性。本研究中恩度及順鉑聯(lián)合給藥優(yōu)于單獨(dú)給藥，分析其原因可能有兩點(diǎn): 首先是順鉑可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的壞死，而恩度可以降低小鼠腹膜滲透性，減少血管生成; 其次，恩度可以促進(jìn)腫瘤血管功能正?；?，改善局部微環(huán)境，更加有效地促進(jìn)順鉑被輸送到腫瘤組織，從而更有效殺滅腫瘤細(xì)胞。

聯(lián)用恩度及順鉑組小鼠腹水量、腹水中紅細(xì)胞比例及生存期均顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥組小鼠，說明恩度和順鉑聯(lián)用具有協(xié)同作用，可有效抑制腹水產(chǎn)生，減少腹水中紅細(xì)胞滲透率，延長小鼠生存期。其中每日給予恩度效果優(yōu)于隔日給予恩度。

[1]Le Corvec M, Jezequel C, Monbet V, et al. Mid-infrared spectroscopy of serum, a promising non-invasive method to assess prognosis in patients with ascites and cirrhosis[J].PLoS One, 2017, 12(10):e0185997.

[2]Bekes I, Friedl TW, Kohler T, et al. Does VEGF facilitate local tumor growth and spread into the abdominal cavity by suppressing endothelial cell adhesion, thus increasing vascular peritoneal permeability followed by ascites production in ovarian cancer?[J]. Mol Cancer, 2016, 15:13.

[3]O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell, 1997, 88(2):277-285.

[4]Zhang YC, Li XM, Yu Z, et al. Efficacy of pEgr-1-endostatin combined with ionizing radiation on hypoxic conditions in nude mice bearing SKOV3 ovarian carcinoma[J]. Oncol Lett,2017, 13(3):1101-1108.

[5]Ren Z, Wang Y, Jiang W, et al. Anti-tumor effect of a novel soluble recombinant human endostatin: administered as a single agent or in combination with chemotherapy agents in mouse tumor models[J]. PLoS One, 2014, 9(9):e107823.

[6]Tong Y, Zhong K, Tian H, et al. Characterization of a monoPEG20000-Endostar[J]. Int J Biol Macromol, 2010,46(3):331-336.

[7]Zhang Q, Cao J, Xue K, et al. Recombinant human endostatin in combination with CHOP regimen for peripheral T cell lymphoma[J]. Onco Targets Ther, 2017, 10:145-151.

[8]Biaoxue R, Xiguang C, Hua L, et al. Thoracic perfusion of recombinant human endostatin (Endostar) combined with chemotherapeutic agents versus chemotherapeutic agents alone for treating malignant pleural effusions: a systematic evaluation and meta-analysis[J]. BMC Cancer, 2016, 16(1):888.

[9]Hochster HS, Piccart M. Intraperitoneal chemotherapy:belly bath or pain in the side[J]. Eur J Cancer Clin Oncol,1987, 23(3):259-261.

[10]Hirayama N, Tabata C, Tabata R, et al. Pleural effusion VEGF levels as a prognostic factor of malignant pleural mesothelioma[J]. Respir Med, 2011, 105(1):137-142.

[11]Abdel-Razik A, Mousa N, Elalfy H, et al. A novel combination of C-reactive protein and vascular endothelial growth factor in differential diagnosis of ascites[J]. J Gastrointest Cancer,2017, 48(1):50-57.

[12]Yin T, Wang G, He S, et al. Malignant pleural effusion and ascites induce epithelial-mesenchymal transition and cancer stem-like cell properties via the vascular endothelial growth factor (VEGF)/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt/mechanistic target of rapamycin (mTOR) Pathway[J]. J Biol Chem, 2016, 291(52):26750-26761.

[13]Yang L, Zhang Y, Cheng L, et al. Mesenchymal stem cells engineered to secrete pigment epithelium-derived factor inhibit tumor metastasis and the formation of malignant ascites in a murine colorectal peritoneal carcinomatosis model[J]. Hum Gene Ther, 2016, 27(3):267-77.

[14]Wei H, Qin S, Yin X, et al. Endostar inhibits ascites formation and prolongs survival in mouse models of malignant ascites[J]. Oncol Lett, 2015, 9(6):2694-2700.

[15]Mostmans Y, Cutolo M, Giddelo C, et al. The role of endothelial cells in the vasculopathy of systemic sclerosis: A systematic review[J]. Autoimmun Rev, 2017, 16(8):774-786.

[16]Han Q, Fu Y, Zhou H, et al. Contributions of Zn(II)-binding to the structural stability of endostatin[J]. FEBS Lett, 2007,581(16):3027-3032.

[17]Mohajeri A, Sanaei S, Kiafar F, et al. The challenges of recombinant endostatin in clinical application: focus on the different expression systems and molecular bioengineering[J]. Adv Pharm Bull, 2017, 7(1):21-34.