TLR識(shí)別在腫瘤化療后免疫應(yīng)答作用研究①

張延梅 林澤杭 周琛斐 吳 砂

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510515)

Toll樣受體是一類可識(shí)別病原體相關(guān)分子模式的蛋白家族，并可通過(guò)激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生細(xì)胞因子及趨化因子以抵抗病原體的入侵[1,2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)放療或化療之后，產(chǎn)生一些報(bào)警蛋白，即損傷相關(guān)分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)，可被機(jī)體通過(guò)TLRs識(shí)別。本綜述重點(diǎn)講述近年來(lái)在腫瘤放化療研究中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗原種類，機(jī)體TLRs(Toll-like receptors)與之結(jié)合的機(jī)制，及其在臨床應(yīng)用方面的研究進(jìn)展。

1 腫瘤化療或放療后，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原類型

腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)放療或化療之后的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，到目前為止共發(fā)現(xiàn)四種：①熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)；②Ⅰ型干擾素;③高遷移率族蛋白1；④三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)。

1.1熱休克蛋白(HSP) HSP是一類高度保守的蛋白家族，正常情況下在蛋白折疊方面起著重要的作用，參與折疊蛋白的形成。當(dāng)生活環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，HSP產(chǎn)生增加，保護(hù)細(xì)胞，抵御外界因素改變。乳腺癌阿霉素化療后，轉(zhuǎn)錄因子brn-3b表達(dá)增加，靶蛋白熱休克蛋白(HSP)分泌，磷酸化HSP-27通過(guò)死亡域相關(guān)蛋白(DAXX)抑制凋亡，HSP-27通過(guò)結(jié)合細(xì)胞色素C抑制凋亡，促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，并促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，使乳腺癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移的能力[3]。在胃癌患者中，過(guò)高表達(dá)的HSP110導(dǎo)致化療敏感性下降，總生存率降低[4]。熱化療引起腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)大量HSP90，作為一種“找我”信號(hào)，樹(shù)突狀細(xì)胞接觸并攝取HSP90抗原復(fù)合物，攝取并提呈給T細(xì)胞，引發(fā)強(qiáng)力的抗腫瘤免疫[5]。對(duì)結(jié)腸直腸癌患者，用奧沙利鉑(OXA)和/或5-氟尿嘧啶(5-Fu)治療后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞釋放高水平的HSP70，促進(jìn)DC的成熟[6]。

1.2Ⅰ型干擾素(IFN) 干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)，主要由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，最近的研究發(fā)現(xiàn)用蒽環(huán)類藥物處理腫瘤，激活細(xì)胞TLR3受體，通過(guò)旁分泌和自分泌途徑分泌Ⅰ型干擾素[7]。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)化療后殘余瘤細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)增高，引起SATA1的磷酸化和IFN-γ的釋放，大量的DNA受損和腫瘤細(xì)胞的凋亡，激活SATA1通路，但效應(yīng)在3周之后消失[8]。

1.3高遷移率族蛋白1(HMGB1) HMGB1是在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的非組蛋白染色體蛋白，具備DNA結(jié)合的特性，能夠調(diào)控DNA復(fù)制、翻譯、再結(jié)合和染色體穩(wěn)定等過(guò)程。HMGB1還和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性有關(guān)，是一種與腫瘤進(jìn)程相關(guān)的蛋白。41名乳腺癌患者接受表柔比星和多柔比星化療的輔助化療(NCT)，發(fā)現(xiàn)早期血漿中HMGB1的濃度變化明顯，且HMGB1濃度越高，腫瘤退化越明顯，可作為一種NCT最終反應(yīng)的生物標(biāo)記[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1化療前后差值大于1.1 ng/ml的患者擁有更高的五年生存率[10]。腫瘤細(xì)胞在化療藥物的刺激下，通過(guò)絲氨酸蘇氨酸激酶3(RIP3)和混合譜系激酶(MLKL)通路，誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡，釋放HMGB1刺激抗瘤反應(yīng)[11]。淋巴瘤細(xì)胞通過(guò)HMGB1引發(fā)自噬反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生耐藥性[12]。然而在小鼠肺癌和人結(jié)腸癌細(xì)胞，化療存活下來(lái)的細(xì)胞通過(guò)糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)，抑制腫瘤壞死因子α的釋放，激活處在靜止期的剩余腫瘤細(xì)胞，引起腫瘤的再生和轉(zhuǎn)移[13]。

1.4三磷酸腺苷(ATP) ATP是一種不穩(wěn)定的高能化合物，是人體細(xì)胞的直接能源物質(zhì)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程中起著重要作用，近來(lái)發(fā)現(xiàn)ATP還是一種報(bào)警蛋白。腫瘤細(xì)胞進(jìn)行化療后，引起免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)，釋放大量ATP到血漿中，刺激垂死腫瘤細(xì)胞周圍免疫受體的增加[14]。

2 DAMP與Toll樣受體結(jié)合的多樣性

TLR是腫瘤化療或放療后產(chǎn)生的DAMP增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要結(jié)合受體，到目前為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)10個(gè)Toll受體家族成員，為TLR1～TLR10。根據(jù)受體位置的不同，可分成膜受體和膜內(nèi)受體兩類，其中TLR1、2、4、5、6、10定位于細(xì)胞膜，結(jié)合細(xì)胞表面或游離的配體；而 TLR3、7、8、9定位于細(xì)胞內(nèi)，為核酸成分的受體。不同的TLR特異性結(jié)合不同的配體，DAMP可識(shí)別多種TLR并激活其下游通路，DAMP和TLRs進(jìn)行結(jié)合，主要通過(guò)以下兩個(gè)通路對(duì)細(xì)胞的生理過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)[15,16]。見(jiàn)圖1。

圖1 TLRs/MyD88依賴性與非依賴性信號(hào)通路Fig.1 TLRs/MyD88 dependent and independent pathway

2.1MyD88依賴性通路 即TLR通過(guò)與MyD88直接結(jié)合(TLR5/7/8/9)或與TIRAP/MyD88復(fù)合物結(jié)合(TLR1/2/4/6)激活下游的IRAKs-TRAF6繼而激活I(lǐng)KK復(fù)合物通路，從而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB使促炎性因子的產(chǎn)生增加[16]。除了TLR3之外，其他所有TLRs都可通過(guò)這個(gè)通路誘發(fā)相應(yīng)的生物效應(yīng)。

2.1.1HMGB1 HMGB1可與TLR2和TLR4結(jié)合，但二者的結(jié)合在結(jié)構(gòu)及機(jī)制上均有所不同，在核小體中的HMGB1與TLR2結(jié)合，游離的HMGB1則與TLR4結(jié)合[17]。Apetoh等[18]發(fā)現(xiàn)，全身化療或局部化療放療后的腫瘤細(xì)胞所釋放的HMGB1可激活TLR4-MyD88通路，臨床數(shù)據(jù)顯示，TLR4 Asp299Gly突變后，會(huì)影響HMGB1與其受體的結(jié)合，從而對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后產(chǎn)生不良影響。

2.1.2HSP HSP主要與TLR4結(jié)合，但HSP60可以和TLR2結(jié)合[4]。Chen等[19]的研究表明，放療后的腫瘤細(xì)胞所釋放的HSP70主要激活DC表面的TLR4-MyD88及TLR4-TRIF通路，從而促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生及DC細(xì)胞的浸潤(rùn)。同時(shí)，Vulpis等[20]報(bào)道，化療后的多發(fā)性骨髓瘤可通過(guò)釋放含HSP70的微囊泡激活NK細(xì)胞表面的TLR2，從而增強(qiáng)抗腫瘤的天然免疫應(yīng)答。

2.2MyD88非依賴性通路 即TLR與TRIF直接結(jié)合或與TRAM/TRIF復(fù)合物結(jié)合，不通過(guò)MyD88激活TRAF3-IKK/TBK1-IRF3/7或TRAF6-IKKs-NF-κB通路，進(jìn)而產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[16]。TLRs家族中，TLR3、7、8、9均能通過(guò)MyD88非依賴性通路發(fā)揮相應(yīng)的作用。

2.2.1IFN TLR3識(shí)別雙鏈RNA/聚肌苷酸-聚胞苷酸[poly(I：C)][21]，IFNα和IFNβ基因的dsRNA的轉(zhuǎn)錄作用依賴于TLR3[22]。雙鏈RNA類似物Poly I:C作用于前列腺腫瘤細(xì)胞，結(jié)合TLR3，激活細(xì)胞內(nèi)IRF3依賴性凋亡途徑，然后自分泌IFN作用于細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡，來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[23]。纖維肉瘤蒽環(huán)霉素化療激活TLR3-IRF通路，產(chǎn)生IFN，與腫瘤細(xì)胞上的IFN受體結(jié)合，產(chǎn)生趨化因子10(CXCL10)，激發(fā)抗腫瘤免疫[24]。

2.2.2HMGB1 Yanai等[25]的結(jié)果顯示，HMGB1能介導(dǎo)依賴于核酸的TLR3和TLR7的激活，同時(shí)，HMGB1可作為DNA的結(jié)合蛋白，激活巨噬細(xì)胞及DC表面的TLR9，從而介導(dǎo)機(jī)體對(duì)CpG-DNA的免疫應(yīng)答[26]。

3 TLRs識(shí)別DAMP在臨床抗腫瘤的應(yīng)用

目前，臨床上對(duì)于TLRs識(shí)別DAMP的研究應(yīng)用主要集中在促進(jìn)DAMP的釋放，同時(shí)增強(qiáng)TLR的表達(dá)，以加強(qiáng)化療藥物的免疫效應(yīng)。化療通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡來(lái)恢復(fù)機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，但Yang等[11]發(fā)現(xiàn)，缺乏RIP3和MLKL的腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1和ATP會(huì)減少，從而產(chǎn)生化療抵抗性，HMGB1可與TLR4結(jié)合以激活DC的下游通路，所以在加入TLR4激動(dòng)劑和ATPase抑制劑后，這種化療抵抗性就會(huì)減弱甚至消失。而對(duì)乳腺癌患者的回顧性臨床分析顯示，TLR4基因(Asp299Gly)單個(gè)核苷酸的突變會(huì)阻斷HMGB1與TLR4的結(jié)合，從而使患者更容易對(duì)蒽環(huán)類化療藥物產(chǎn)生抗性[18]。順鉑可使腫瘤細(xì)胞死亡，釋放出內(nèi)容物，包括HMGB1、HSP等，激活DC表面的TLR4-MyD88通路，Belani等[27]做隨機(jī)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)于晚期的非小細(xì)胞肺癌，化療藥物順鉑-紫杉醇與TLR2激動(dòng)劑結(jié)合的治療方案與單用順鉑-紫杉醇療法相比，患者127天的平均存活率更高。按化療加免疫方案治療四個(gè)循環(huán)后，患者總的生存率提高了66天。臨床上理想的誘導(dǎo)免疫原性的細(xì)胞死亡的化療藥物應(yīng)該在腫瘤細(xì)胞凋亡之前或早期凋亡階段就可以促進(jìn)多種類型的DAMP、TLR激動(dòng)劑及免疫原性分子的釋放，從而確保免疫系統(tǒng)對(duì)垂死腫瘤細(xì)胞的敏感性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤免疫應(yīng)答[28]。

4 結(jié)語(yǔ)

TLR是腫瘤放化療產(chǎn)生DAMP的主要結(jié)合受體，在激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答、增強(qiáng)治療效果方面有著重要作用。腫瘤細(xì)胞在放療后所釋放的HMGB1、HSP、IFN等物質(zhì)通過(guò)與免疫細(xì)胞的TLR結(jié)合，激活下游的MyD88依賴性和非依賴性通路，從而發(fā)揮天然免疫和適應(yīng)性免疫作用殺傷腫瘤細(xì)胞。ATP也是一種報(bào)警蛋白,但目前尚未發(fā)現(xiàn)ATP可與TLR結(jié)合。對(duì)DAMP和TLR的研究有助于闡明機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答機(jī)制，為診斷、治療腫瘤或研發(fā)疫苗提供新思路。目前以DAMP為佐劑的疫苗已經(jīng)得到廣泛研究，但還未進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，但TLR激動(dòng)劑作為化療藥的輔助藥物已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。DAMP的釋放有腫瘤異質(zhì)性及個(gè)體差異性，如何設(shè)計(jì)出有效的個(gè)體化疫苗仍是目前亟待解決的問(wèn)題。

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